原發性肝癌患者外周血KRAS基因水平及其對西妥昔單克隆抗體治療療效的影響

崔發強，李 濤，王 錚，陳 青

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）為臨床常見的惡性腫瘤，流行病學調查結果顯示其病死率僅次于胃癌和食管癌，男性多發[1]。由于發病相對隱匿，早期缺乏典型表現，故大部分患者確診時已進展為中晚期，失去了手術機會，因此多接受以化療為主的綜合治療，其中順鉑化療方案聯合西妥昔單克隆抗體（cetuximab，C225）治療已被廣泛應用[2]。順鉑為細胞周期非特異性抗腫瘤藥，抗癌活性強，與其他抗腫瘤藥物交叉耐藥發生率低，是臨床上應用最廣泛的抗腫瘤藥[3]。C225作為針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的單克隆抗體代表性藥物，有資料顯示其作為一線或二線藥物治療復發或有轉移的結直腸癌、PLC和鼻咽癌患者顯示了較好的療效，其中C225適用于KRAS野生型結直腸癌患者，而KRAS基因突變狀態已成為預測C225治療療效的關鍵性生物學標志物[4]。我們應用C225治療96例PLC患者，觀察了KRAS基因表達及其對療效的影響，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年8月～2017年8月我院收治的PLC患者96例，男70例，女26例；年齡18～62歲，平均年齡為（46.71±12.60）歲。符合《原發性肝癌診療規范（2011年版）》[5]的診斷標準，均經影像學或組織病理學檢查診斷，腫瘤為單發或多發，Karnofsky（KPS）評分≥60分，均為初次診斷；臨床分期為Ⅲa～Ⅲb期，肝功能Child-Pugh A級或B級；近1個月內未行放化療、生物治療或局部消融治療。排除標準:（1）轉移性肝癌；（2）合并嚴重的心、腦、腎、肺等原發性疾病或精神疾患；（3）伴肝外轉移、肝門淋巴結轉移或門靜脈癌栓；（4）存在上腹部手術史，合并腹腔內粘連、門靜脈高壓癥、活動性胃腸道出血、大量腹水等并發癥，或合并其它病毒感染或酒精性肝病和藥物性肝損傷；（5）癌灶占全肝比例≥70%；（6）伴血小板或粒細胞減少，或存在嚴重的凝血功能障礙；（7）妊娠期或哺乳期婦女。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有患者吉西他濱（ELI LILLY AND COMPANY，注冊證號 H20110535）1000mg·m2靜脈滴注，第1～8 d；順鉑注射液（江蘇豪森藥業集團有限公司，國藥準字 H20040813）30 mg·m2·d-1靜脈滴注，第1～4 d。以21 d為1個周期，持續治療2個周期，中間間隔3 w。在此基礎上，給予C225（德國默克公司，批準文號S20130004）400 mg·m2靜脈滴注，時間＜2 h，持續1 w后調整為250 mg·m2，靜脈滴注時間＜1 h，1次/w，連續治療8 w。

1.3 檢測方法 使用2720基因擴增儀（美國ABI公司），采用人類KRAS/NRAS基因突變聯合檢測試劑盒（上海生工生物技術服務有限公司）檢測外周血KRAS基因突變，應用Alphalmager HP凝膠成像分析系統（美國Alpha公司）鑒定基因型結果。KRAS基因分為野生型（W）和突變型（M），常見突變位點為1號外顯子（exon 1）的第12和13號密碼子（condon 12、13），其中 condon 12突變類型包括GGT-GAT、GGT-GCT、GGT-GTT 和 GGT-TGT，condon 13突變類型為GGC-GAC。

1.4 療效判定 參考《原發性肝癌診療規范（2011年版）》[6]，分為完全緩解（complete response，CR），CT提示腫瘤病灶完全消失，持續時間＞4周；部分緩解（partial response，PR），腫瘤病灶縮小＞50%，持續時間＞4周，未出現新病灶；疾病穩定（stable disease，SD），腫瘤病灶增大＜25%，或病灶縮小＜50%；疾病進展（progressive disease，PD），腫瘤病灶增大＞25%，或出現新病變。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，組間行t檢驗。計數資料的比較采用x2檢驗；采用Logistic單因素和多因素回歸分析影響療效的獨立因素，P＜0.05時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 短期療效分析 在治療8 w末，在96例PLC患者中，PR 59例（61.5%），SD 22例（22.9%），PD 15例（15.6%）。

2.2 兩組基線資料比較 見表1。

表1 兩組一般資料【（±s），n（%）】比較

表1 兩組一般資料【（±s），n（%）】比較

與PD組比，①P＜0.05

PR/SD（n=81） PD（n=15）年齡（歲） 46.7±12.7 47.4±12.0男性 59（72.8） 11（73.3）體質指數（kg/m2） 22.3±4.2 23.7±5.7腫瘤直徑(cm)≤5 70（86.4） 9（60.0）＞5 11（13.6）① 6（40.0）Child分級A級 61（75.3）① 7（46.7）B級 20（24.7） 8（53.3）腫瘤部位左半肝 52（64.2） 8（53.3）右半肝 29（35.8） 7（46.7）臨床分期Ⅲa期 67（82.7） 12（80.0）Ⅲb 期 14（17.3） 3（20.0）腫瘤類型結節型 39（48.2）① 2（13.3）彌漫型 32（39.5） 5（33.3）塊狀型 10（12.3） 8（53.4）KRAS基因分型W 73（90.1）① 9（60.0）M 8（9.9） 6（40.0）血清甲胎蛋白（μg/L） 441.2±28.9① 509.4±39.3

2.3 兩組KRAS基因突變類型和突變率比較 KRAS突變發生在1號外顯子的第12和第13號密碼子，PR/SD組GGT-GAT、GGT-GTT和GGC-GAC突變率顯著低于PD組（P＜0.05，表2）。

2.4 影響療效的多因素Logistic回歸分析 將上述有差異的單因素作為自變量，按照連續變量賦值，納入多因素Logistic回歸統計分析，經逐步回歸法篩選變量，結果顯示，除肝功能Child分級和腫瘤類型外，KRAS基因突變亦為影響C225治療PLC患者療效的獨立因素（P＜0.05，表3）。

表2 兩組KRAS基因突變類型和突變率（%）比較

表3 影響C225治療PLC患者療效的多因素

3 討論

肝癌是多階段、多因素共同累積作用的結果，其中基因突變和分子信號傳導通路異常激活與PLC的形成和發展密切相關[7，8]。研究發現，EGFR所介導的級聯通路活化是PLC發生、侵襲和轉移的獨立危險因素[9，10]。EGFR作為一種跨膜酪氨酸激酶受體，在多種實體瘤，如胃癌、肺癌、結直腸癌、卵巢癌、PLC等，均存在表達，其結合配體活化激活下游信號傳導通路有兩條，即RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT，在細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程中有重要的調節作用[11]。既往報道表明，EGFR靶向治療通過應用特定分子靶向藥物識別和攻擊腫瘤細胞特定分子靶點，可控制腫瘤發展、侵襲、轉移，且其應用不損傷正常細胞，低毒，能顯著改善PLC患者的臨床癥狀，有一定的療效[12]。

本研究顯示，96例PLC患者在順鉑化療的基礎上接受C225治療8周后疾病控制率為84.4%，說明聯合C225的綜合化療方案治療PLC患者有一定的療效，與有關研究[13]結論一致。C225作為一種人鼠嵌合型IgG1抗體，以EGFR為靶點，與EGFR有較強的親合力，是天然配體的5～10倍，可竟爭性地結合EGFR胞外區域，阻止天然配體EGF、GF-α與EGFR的結合，調節酪氨酸激酶激活，阻斷細胞內信號傳導通路，促使信號傳導通路所介導的多種生物學行為受抑，并誘導促凋亡基因Bax及細胞周期抑制蛋白P27表達上調，影響腫瘤細胞DNA復制及瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等。同時，還可刺激EGFR內吞噬細胞，減少細胞表面受體信號，下調受體水平，改善腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高化療藥物療效。C225可結合自然殺傷細胞Fc受體，基于抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞[14，15]。C225在復發、轉移的晚期結直腸癌、PLC等患者，作為一線及二線治療能取得良好的效果，但目前僅有資料顯示KRAS基因突變已成為預測單克隆抗體治療結直腸癌患者療效的重要生物學標志物[16]。

本研究顯示，KRAS突變發生在1號外顯子的第12和第13號密碼子，在有效組KRAS突變率和GGT-GAT、GGT-GTT、GGC-GAC 突變率均明顯低于PD組，經Logistic回歸分析發現，除肝功能Child分級、腫瘤類型外，KRAS突變亦為影響C225短期治療PLC患者效果的獨立因素。有報道回顧性研究540例結直腸癌患者，發現KRAS基因突變率達35.6%，其中348例KRAS野生型患者中C225聯合FOLFIRI治療組客觀有效率和疾病無進展生存時間均優于FOLFIRI治療組，證實KRAS基因有無突變是預測C225治療療效的重要分子生物學標志物[17]。目前，雖無報道KRAS基因突變與C225治療PLC患者療效的文獻，但有報道稱EGFR信號傳導通路中其它成員與單抗治療療效密切相關，KRAS基因作為EGFR信號傳導通路中的重要分子，其突變是PLC發生、發展過程中的早期事件，與PLC形成、侵襲、轉移有關，在原發灶、轉移灶中，KRAS基因突變狀態有著高度的一致性[18，19]，究其根源，KRAS 基因突變多發生于1號外顯子的第12、13、61號密碼子，此位點突變能激活KRAS基因，刺激KRAS基因編碼蛋白的G蛋白結合域，導致內在GTP酶持續活化，促使KRAS/RAF/MAPK通路不再依賴EGFR活化而持續激活，導致細胞增殖改變，故與PLC發生、侵襲、轉移有關[20]。一旦KRAS基因突變后會引起信號傳導通路持續激活，而靶向EGFR抑制劑（C225）對腫瘤細胞生長的抑制作用也將喪失，故KRAS基因狀態與抗EGFR單克隆抗體治療的療效關系密切[21-24]。有人報道PLC伴肝外轉移患者KRAS基因突變率為24%，而本研究未涉及KRAS基因與肝癌轉移的關系，有待今后深入調查研究。也有報道稱KRAS并不能完全預測單抗治療的療效，可能與樣本量大小等因素有關，也有待今后觀察。