人參莖葉總皂苷對腎上腺素致家兔肺水腫的保護機制研究*

李福智，侯陽

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 胸外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學 生命科學研究院，遼寧 錦州 121001）

近年來國內學者確認了人參具有改善糖尿病、保護心肌組織等作用[1-2]。有實驗證實人參莖葉總皂苷能改善小鼠實驗性肺纖維化，對博來霉素所致的小鼠肺纖維化具有保護作用，其作用機制可能與其抑制氧化損傷有關[3]。本課題探討人參莖葉總皂苷對腎上腺素（Adrenaline, AD）致家兔肺水腫的作用及 機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

普通級家兔，體重2～3 kg，雌雄各半，由錦州醫(yī)科大學提供[SCXK（遼）2017-0002]。人參莖葉總皂苷（純度82%，遼寧新賓制藥有限公司），AD（上海禾豐制藥有限公司），氨基甲酸乙酯（國藥集團化學試劑有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，C/EBPα、mTOR及S6K1抗體均購自上海生工生物工程股份有限公司，SirT1、NLRP3抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司，兔二步法檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。BL-420生物機能實驗系統(tǒng)、張力換能器購自成都泰盟軟件有限公司，石蠟切片機（德國萊卡公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 藥物干預及取材

將18只家兔隨機分成對照組、模型組和治療組，每組6只。家兔稱重后，常規(guī)麻醉（質量分數(shù)25%氨基甲酸乙酯4 ml/kg耳緣靜脈注射）、固定，行氣管插管，并與BL-420生物信號采集系統(tǒng)連接，記錄呼吸變化。對照組：灌胃等體積生理鹽水。模型組：灌胃等體積生理鹽水，30 min后耳緣靜脈注射AD 1 mg/只，復制AD肺水腫模型，觀察30 min。治療組：以50 mg/kg灌胃人參莖葉總皂苷，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后耳緣靜脈注射AD 1 mg/只，并觀察30 min。觀察完畢，處死家兔，取肺臟觀察并稱量其濕重，計算肺系數(shù)=肺濕重（g）/體重（kg）×100%。取肺組織，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA。

1.3 病理學觀察

常規(guī)石蠟切片和蘇木精-伊紅染色。參照王寶娟 等[4]的方法對肺組織進行病理損傷評分。采用免疫組織化學SP檢測C/EBPα蛋白在石蠟包埋標本的表達情況。按試劑盒說明書進行操作，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗作為陰性 對照。

1.4 流式細胞術

取肺組織，用眼科剪將組織剪碎、勻漿，使用移液槍反復吹散，直至無明顯的組織塊，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾后，1 500 r/min離心3 min，除去上清，連續(xù)3次后棄上清。按1∶100稀釋mTOR和S6K1一抗，每管加入75μl，室溫孵育30～60 min。加入500μl PBS洗滌2次，所有管內加入l∶100稀釋的75μl Cy3標記的熒光二抗，室溫孵育20～30 min。加入500μl PBS洗滌2次待測。流式細胞儀激光管預熱30 min，用熒光微球調整儀器。以對照管為空白定標，計算1×104個細胞，采用流式細胞儀配套軟件進行數(shù)據(jù)讀取和分析，記錄標本mTOR和S6K1蛋白的 表達。

1.5 Western blotting

取肺組織放入液氮研磨，加入500μl裂解液與磷酸酶抑制劑混合液（100∶1）充分裂解。用聚氰基丙烯酸正丁酯試劑盒檢測樣品蛋白濃度。轉膜后 Western blotting封閉液封閉30 min。一抗4℃孵育過夜，二抗孵育2 h，曝光顯影檢測蛋白質。依據(jù)劉梅梅等[5]的方法計算條帶與β-actin的平均光密度比值

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素或重復測量設計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較

各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；進一步兩兩比較，模型組肺系數(shù)、MDA較對照組升高（P ＜0.05），SOD較對照組降低（P ＜0.05）；治療組肺系數(shù)、MDA較模型組降低（P ＜0.05），SOD較模型組升高（P ＜0.05）。見表1。

2.2 各組靜脈注射AD后呼吸頻率比較

各組靜脈注射AD后呼吸頻率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的呼吸頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F =423.976，P =0.000）；②各組呼吸頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F =1229.138，P =0.000），模型組家兔靜脈注射AD后10、20及30 min的呼吸頻率高于對照組和治療組，呼吸急促表淺；③各組呼吸頻率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F =213.900，P =0.000）。見表2和 圖1。

表1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較 （n =6，±s）

表1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較 （n =6，±s）

組別肺系數(shù)MDA/（nmol/mg）SOD/（u/ml）對照組4.9±0.90.9±0.18.6±1.3模型組11.5±1.43.1±0.34.5±0.6治療組8.8±1.21.5±0.17.8±1.1 F值7.26635.2194.166 P值0.0060.0000.036

表2 各組靜脈注射AD后不同時間呼吸頻率比較 （n =6，次/min，±s）

表2 各組靜脈注射AD后不同時間呼吸頻率比較 （n =6，次/min，±s）

組別10 min20 min30 min對照組40.0±4.739.2±4.339.7±5.1模型組99.6±5.5133.9±6.2159.3±6.1治療組82.0±3.3119.0±4.2112.6±4.9

2.3 人參莖葉總皂苷對各組AD所致肺水腫病理學變化的影響

對照組肺組織肺泡無萎陷，無毛細血管擴張、充血及白細胞附壁，肺泡和肺間質無炎癥細胞浸潤，肺泡壁無增厚現(xiàn)象；模型組見肺泡壁斷裂，肺泡隔明顯增寬，有塵細胞。治療組肺組織上述改變明顯減輕。C/EBPα在細胞質和細胞核中均表達，陽性染色呈現(xiàn)粗大棕黃色顆粒。對照組陽性細胞少。模型組與對照組比較，陽性細胞表達增加。治療組較模型組陽性細胞表達減少。見圖2、3。

圖1 各組靜脈注射AD 30 min后呼吸曲線變化

2.4 各組肺組織損傷評分比較

對照組、模型組和治療組肺組織損傷評分分別為（0.7±0.1）、（4.3±0.9）和（2.6±0.6）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =5.123，P =0.020）；模型組較對照組升高（P ＜0.05），治療組較模型組降低（P ＜0.05）。

2.5 各組mTOR和S6K1蛋白表達率比較

對照組、模型組和治療組mTOR蛋白表達 率分別為（3.05±0.98）%、（8.02±0.98）%和（4.36± 1.00）%，對照組、模型組和治療組S6K1蛋白表達率分別為（3.03±0.96）%、（12.44±1.08）%和（5.05±0.99）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =6.904和25.708，P =0.007和0.000），模型組較對照組升高（P ＜0.05），治療組較模型組降低（P ＜0.05）。見 圖4。

圖2 肺組織切片光鏡圖 （HE×100）

圖3 肺組織CCAAT增強子結合蛋白α的切片光鏡圖 （×200）

圖4 各組mTOR和S6K1蛋白的表達

2.6 各組NLRP3和SirT1蛋白相對表達量比較

對照組、模型組和治療組NLRP3蛋白相對表達量分別為（0.41±1.01）、（0.83±1.09）和（0.70±0.98），SirT1蛋白相對表達量分別為（0.51±0.05）、（0.32± 0.02）和（0.55±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =4.810和6.768，P =0.024和0.008），模型組NLRP3蛋白相對表達量較對照組升高（P ＜0.05），SirT1蛋白相對表達量較對照組降低（P ＜0.05），治療組NLRP3蛋白相對表達量較模型組降低（P ＜0.05），SirT1蛋白相對表達量較模型組升高（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 各組NLRP3和SirT1蛋白的表達

3 討論

本實驗復制AD致急性肺水腫家兔模型，從肺系數(shù)變化、呼吸變化和組織學來探討人參莖葉總皂苷對肺水腫的作用。本研究結果顯示，治療組的肺系數(shù)較模型組減小，家兔在靜脈注射AD后10、20及30 min呼吸頻率低于模型組，在組織學方面也有改善作用，表明人參莖葉總皂苷對家兔AD型肺水腫有一定治療效果。同時，本研究也考察了人參莖葉總皂苷對肺臟抗氧化的作用。人參莖葉總皂苷對AD所致的肺水腫具有保護作用，其作用機制可能與其抑制氧化損傷有關。與文獻[6-7]顯示人參莖葉總皂苷抗氧化作用一致。

C/EBPα是CCAAT增強子結合蛋白家族的重要成員，C/EBPα對肺上皮細胞的發(fā)育和分化有重要作用[8]。關于C/EBPα與肺相關疾病的研究更多是關于肺癌方面，最近研究顯示C/EBPα抑制肺腺癌細胞侵襲和遷移[9]。本研究顯示模型組C/EBPα表達增多，而治療組則顯示C/EBPα減少，因此筆者推測人參莖葉總皂苷是通過抑制C/EBPα的表達，而降低急性肺損傷。

mTOR可以協(xié)調許多合成代謝和分解過程，也是調節(jié)細胞的增殖與分化及蛋白質合成關鍵信號中 樞[10]。有報道顯示，肺上皮中mTOR的活化促進脂多糖誘導的急性肺損傷[11]。人參皂苷Rh2通過調節(jié)小鼠TLR4/PI3K/AKT/mTOR、Raf-1/MEK/Erk和Keap1/Nrf2/HO-1信號通路，改善脂多糖誘導的急性肺損傷[12]。mTOR/p70S6K信號通路與很多損傷研究有關。在體外氧化應激模型中，柚皮素能降低細胞內氧自由基的積累，提高細胞的存活率。其機制可能與激活mTOR/p70S6K信號通路、改善胰島素有關[13]。急性肺損傷病程中mTOR信號通路活化，應用雷帕霉素可有效抑制mTOR信號通路過度活化，并能部分緩解肺組織病理損傷程度[14]。本研究提示人參莖葉總皂苷對AD所致家兔肺損傷有保護作用，其機制可能與抑制mTOR/S6K1蛋白表達有關。

有學者報道NLRP3炎性蛋白肺損傷和肺組織炎癥有關[15-16]。SIRT1抑制NLRP3炎癥小體[17]。另外，人參皂苷對NLRP3炎性體激活有抑制作用[18]。結合文獻[16-18]與本研究結果提示，人參莖葉總皂苷對AD所致家兔肺損傷有保護作用，其機制可能與SIRT1/NLRP3蛋白表達有關。

綜上所述，本研究通過動物模型實驗探討人參莖葉總皂苷對急性肺損傷的作用及C/EBPα、mTOR信號通路機制。結果顯示，人參莖葉總皂苷對AD急性肺損傷異常病理狀態(tài)有改善作用，改善肺組織氧化指標和凋亡，可能與C/EBPα、mTOR信號及SIRT1/NLRP3通路有關。