高原地區妊娠期高血壓產婦胎盤Stat3、Survivin及MMP-2的表達水平及意義

李宗英，趙得熊，張海燕，郝麗娟

（青海紅十字醫院 1.婦產科，2.耳鼻喉科，青海 西寧 810000）

妊娠期高血壓疾病是女性妊娠期的常見并發癥，近年來發病率呈逐漸上升趨勢，且高原地區發病率高于平原地區[1-2]。關于妊娠期高血壓疾病的發生機制尚未有統一定論。有研究證實胎盤中滋養細胞參與妊娠期高血壓疾病的發生，胎盤組織中信號傳導、轉錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3, Stat3）、Survivin及基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）與滋養細胞能力下降密切相關[3-4]。本研究檢測高原地區妊娠期高血壓患者胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2的表達，以探究高原環境中妊娠期高血壓疾病的發生與3者的聯系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月—2017年4月在青海紅十字醫院行分娩的79例產婦作為研究對象。將產婦分為輕中度組、重度組和正常組，分別為30、27和22例。其中，輕中度組產婦年齡19～38歲，平均（28.64±3.21）歲；分娩孕周38～40周，平均（39.69±2.34）周。重度組產婦年齡20～39歲，平均（29.13±3.54）歲；分娩孕周39～40周，平均（39.09±2.16）周。正常組產婦年齡22～39歲，平均（27.86±2.67）歲；分娩孕周38～40周，平均（39.73±3.06）周。納入標準：①符合《婦產科學》[5]診斷標準；②單胎妊娠。排除標準：①高血壓、心腦血管及糖尿病病史；②心、肝、腎及免疫系統存在嚴重缺陷；③出現胎膜早破、前置胎盤及胎兒窘迫等異常情況。研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集產婦分娩后在無菌環境中剪取臍帶根部面積約0.5 m2的胎盤組織，生理鹽水漂洗后用紗布吸干水分，一部分放入-80℃冰箱中保存，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.2 胎盤組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色常規制備胎盤組織石蠟切片，脫水后進行蘇木精復染，浸入1%鹽酸5 s后水洗，加入伊紅染液染色脫水，滴加二甲苯進行透明處理，用中性樹脂進行封片，將切片放置顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）從冰箱中取出保存胎盤組織，采用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，反應體系：10×cDNA模板1μl，正反向引物各0.5μl，H2O 8μl，10μl 2×SYBR Mix。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共計35個循環，72℃繼續延伸10 min。運用CFX manager 3.0軟件以β-actin作為內參基因按照2-ΔΔCt法進行基因相對定量分析。

1.2.4 免疫組織化學法胎盤組織石蠟切片脫水后置于檸檬酸鹽緩沖液中20 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）清洗后，加入3%過氧化氫溶液放置25 min。PBS清洗后，滴加山羊血清反應15 min，加Stat3、Survivin及MMP-2一抗置于4℃冰箱中過夜。PBS清洗后加入二抗，室溫下孵育20 min后加入DAB顯色液進行顯色反應。水洗后，進行蘇木精復染，蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5 s后清洗，脫水后滴加二甲苯進行透明處理，用中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。每張切片挑選10個視野，計算陽性染色細胞數比例，當比例＜5%細胞總數為陰性，比例介于5%～100%為 陽性。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以率（%）表示，用χ2檢驗，進一步兩兩比較用χ2分割法，檢驗水準α=0.0125，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胎盤組織HE染色結果

正常組胎盤組織中絨毛血管數量較多且體積小，血管壁均未見異常。輕中度組胎盤中絨毛數量有所下降，且滋養細胞增多形成結節，宮腔變窄，管壁周圍出現纖維狀壞死。而重度組情況更為嚴重。見圖1。

2.2 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較

各組Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P ＜0.05）；進一步兩兩比較，輕中度組各指標均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組胎盤組織染色結果 （HE×100）

表1 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較 （±s）

表1 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較 （±s）

組別nStat3SurvivinMMP-2正常組220.85±0.080.89±0.070.81±0.05輕中度組300.72±0.040.74±0.030.68±0.03重度組270.63±0.010.57±0.030.59±0.02 F值121.865312.736251.124 P值0.0000.0000.000

圖2 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA 水平比較 （±s）

2.3 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較

Stat3、Survivin及MMP-2陽性細胞主要分布于胞漿中，呈棕黃色。各組Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）；輕中度組各指標陽性率均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標陽性率均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表2和圖3。

2.4 各組胎盤和新生兒資料比較

各組胎盤重量、新生兒身高及體重比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P ＜0.05）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，輕中度組各指標均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表3。

表2 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較 例（%）

圖3 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白表達情況 （×100）

2.5 Stat3、Survivin、MMP-2的相關性分析

Stat3、Survivin及MMP-2相互間及其與胎盤重量、新生兒體重均呈正相關（P ＜0.05）。Survivin與身高呈正相關（P ＜0.05）。見表4。

表3 各組胎盤和新生兒資料比較 （±s）

表3 各組胎盤和新生兒資料比較 （±s）

組別n胎盤重量/kg新生兒身高/cm新生兒體重/kg正常組220.53±0.1152.24±1.683.14±0.51輕中度組300.46±0.0651.16±2.062.47±0.48重度組270.39±0.0450.13±1.471.91±0.34 F值22.6578.61946.006 P值0.0000.0030.000

表4 Stat3、Survivin、MMP-2的相關性分析

3 討論

高原地區海拔一般＞3 000 m，氣候惡劣，紫外線輻射強，高寒缺氧，體內供氧和耗氧常失衡，導致一系列的病理生理改變，例如對血液流變學及血管收縮產生較大的影響，血液易發生濃縮現象且血容量明顯降低，這些因素均為妊娠期高血壓疾病的發生提供條件[6]。本研究通過檢測高原地區產婦胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2的表達，試圖闡明在高原環境中3者的表達與妊娠期高血壓疾病發生的聯系。

胎盤病變在妊娠期高血壓疾病的發生中起重要作用，有學者認為滋養細胞發生異常是胎盤病變的前提[7]。本研究顯示盤中絨毛數量下降，且滋養細胞增多形成結節，血管發育不良，重度組情況更為嚴重，分析原因可能為母體發生病變的情況下滋養細胞對子宮的侵襲能力下降，導致子宮螺旋動脈功能重塑受阻，血管變窄，絨毛間隙狹窄，進而加重病情[8]。本研究結果顯示，妊娠期高血壓疾病患者MMP-2 mRNA、陽性表達低于正常分娩者，隨著病情程度的增加陽性表達率逐漸降低，可能是MMP-2在滋養細胞中含量下降，使浸潤能力受影響，導致絨毛發育不良胎盤病變。細胞外基質降解在滋養細胞侵襲中發揮著關鍵作用，有研究發現MMP-2等基質金屬蛋白酶參與此過程，能夠分解膠原、凝膠、黏連蛋白等，且妊娠期高血壓疾病者MMP-2蛋白表達低于正常妊娠者[9]。本研究結果與以上研究相符合，提示MMP-2與妊娠期高血壓疾病的發生相關。

Survivin屬于細胞凋亡抑制因子，在胚胎、胎兒組織中高度表達。Stat3是Stat蛋白家族成員，能夠通過信號轉導途徑對凋亡相關因子進行調控進而促進細胞的增殖、凋亡。相關研究顯示Survivin在整個妊娠過程中均有表達，且Survivin在妊娠期高血壓疾病患者中水平低于正常者[10]。Stat3水平升高能夠激活抑癌基因P21以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表達發揮抗凋亡、促增殖的作用[11]。本研究顯示妊娠期高血壓疾病患者胎盤中Survivin、Stat3陽性表達率低于正常分娩者，隨著病情程度的增加其表達水平逐漸降低。有研究發現，胎盤組織中Survivin表達下降導致細胞過渡凋亡，從而降低胎盤功能，Stat3蛋白表達降低能夠抑制滋養細胞侵襲[12-13]。以上研究表明Survivin、Stat3蛋白與妊娠期高血壓疾病的發生、病情進展相關。本研究還發現Stat3、Survivin及MMP-2相互間呈正相關，且3者與胎盤重量、新生兒體重呈正相關，說明Stat3、Survivin、MMP-2的表達與胎盤以及胎兒的生長、發育密切相關，可以根據3者蛋白表達對患者病情程度及新生兒預后進行評估。

綜上所述，Stat3、Survivin及MMP-2蛋白與妊娠期高血壓疾病的發生密切相關，且與病情嚴重程度及新生兒預后相關，為妊娠期高血壓疾病的治療提供一定的參考，但本研究僅從組織學方面進行檢測，其具體生理機制及分子機制還需后續深入研究。