伏馬毒素B1對豬腎上皮細胞增殖的影響

袁巧玲，范 穎，寧玲忠，蘇建明，雷紅宇

（湖南農業大學，長沙 410128）

伏馬毒素B1（FB1）屬于一種煙曲霉毒素，是串珠鐮刀菌產生的次級代謝產物[1]。其主要污染玉米、大豆、小麥等糧食作物及其制品[2]。FB1已經被證明在所有伏馬毒素中毒性最強。該毒素熱穩定性較好，成為危害畜禽健康的一個重要原因[3]。伏馬毒素可引起人類食管癌和神經管型缺陷病、馬與兔的腦組織損傷、靈長類動物動脈粥樣硬化、豬肺水腫等[4]。隨著國內外毒理學研究工作者的不斷探索，該毒素對人類、植物以及動物的毒性作用與機制逐漸地被挖掘。但是目前還沒有詳盡的證據支撐其是否對體外培養的豬腎上皮細胞具有增殖抑制效應。因此，本文以豬腎上皮細胞為體外研究模型，探究PK15細胞染毒FB1后對其細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

FB1購于Sigma公司；豬腎上皮細胞PK15由湖南農業大學動物醫學院饋贈。

1.2 MTT檢測細胞增殖

取PK15細胞懸液，接種于96孔板，預培養過夜。將培養基更換為含有FB10、10、20、40 μg·mL-1的新鮮培養基。培養24和48 h時，棄去培養基，依次加入100 μL·孔-1的新鮮培養基（含MTT溶液10 μL），避光培養4 h后棄上清，加二甲基亞砜150 μL，混勻。10 min后，于酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度，計算細胞相對活力。

1.3 qPCR檢測周期相關基因的mRNA表達水平

PK15細胞在染毒處理48 h后，根據TRIZOL試劑盒（全氏金生物科技有限公司）說明書，提取細胞總RNA。測定RNA濃度，反轉錄得cDNA。將cD?NA稀釋，加入熒光定量qPCR的其他反應試劑。將反應體系放入熒光定量PCR儀進行擴增并分析數據。以GAPDH為內參基因，采用2－ΔΔCT法計算目的基因的相對水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統計分析

試驗數據采用SPSS 21.0進行處理，兩組間比較為t檢驗，多組間的比較應采用單因素方差分析，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 FB1對PK15細胞活力的影響

MTT檢測細胞活力的結果見圖1。

由圖1可知，FB1作用于PK15細胞24 h后，細胞活力未出現下降變化，但是當FB1作用時間增加到 48 h 時，40 μg·mL-1FB1組中細胞活力顯著下降。表明FB1能降低PK15細胞活性，抑制細胞的增殖。

2.2 FB1對PK15細胞周期相關基因表達的影響

qPCR檢測結果見圖2。

圖1 FB1對PK15細胞活性的影響

圖2 FB1對PK15細胞周期相關基因表達水平的影響

由圖2可知，與對照組相比，FB1處理組中細胞核增殖抗原PCNA（圖2 C）與細胞周期蛋白Cyclin B（圖2 A）和Cyclin D（圖2 B）的mRNA表達水平顯著下降，而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21（圖2 D）和P27（圖2 F）的mRNA表達水平顯著增加。

3 討 論

FB是一種常見的霉菌毒素，對畜牧業存在很大的威脅。有研究報道，FB能降低畜禽的生長性能[5]。但是由于毒物的獲得問題，當前國內外對該毒素的動物體內毒性研究多集中在FB這一類化合物上的探索，而非單一的高純度FB1。這也很難闡明其毒性的產生是否與FB1有直接關聯，甚至很難確定FB1是否在發揮主導的毒性作用。另外，腎臟是動物的主要排泄器官，也是多種毒素主要攻擊的對象。該臟器的嚴重損傷對動物的泌尿系統會產生不可忽視的危害。因此本研究探索了FB1對豬腎上皮細胞PK15增殖的影響，研究證實，高濃度的FB1處理PK15細胞48 h顯著地抑制了該細胞的增殖。

細胞增殖是細胞的基本生物學特性，異常的細胞增殖或過度增殖都可能會影響細胞的生理功能。腎上皮細胞是構成腎臟的基本結構單元。腎上皮細胞的增殖受到抑制，與腎臟疾病有一定關聯，影響腎臟的代謝和排泄功能。細胞周期蛋白調控細胞的增殖，一個完整的細胞周期需要由不同的細胞周期相關蛋白參與[6]。目前已發現的與細胞周期調控有關的分子主要包括3大類：細胞周期蛋白（Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E等），細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK-2等），細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（P21、P27等）。其中CDKs是調控網絡的核心，Cyclins對CDKs具有直接調控作用，P21與P27等對細胞增殖具有負性調控作用，共同構成細胞周期調控的分子基礎[7]。PCNA是細胞增殖核抗原，在細胞增殖的啟動上發揮重要作用[8]。本研究發現，FB1顯著抑制了PCNA的mRNA表達，細胞周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表達顯著下降，推測細胞增殖受到抑制可能與細胞在G1到S的進程中受到阻滯有關。同時也發現，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21和P27的表達顯著增加。研究證實，伏馬毒素對其他動物細胞存在抑制細胞增殖作用，即FB15~20 μg·mL-1可使人臍靜脈血管內皮細胞的增殖阻滯在G0/G1期，導致細胞增殖受到抑制[9]。綜上所述，FB1可通過調控周期調控相關基因的表達，抑制豬腎上皮細胞的增殖。