多重膠體金免疫層析法檢測乳品中β-內酰胺類、四環素類、頭孢氨芐抗生素殘留

袁曉春

（遼寧省錦州市農業農村綜合服務中心，遼寧 錦州 121000）

乳品營養豐富，易消化吸收，且價格相對偏低，是人們日常生活中攝入較多的營養食品。然而在畜禽飼養過程中，為防治奶牛乳腺炎等疾病，常大規模使用β-內酰胺類（青霉素類和頭孢類）和四環素類抗生素[1]。不合理使用藥物易導致抗生素在乳品中殘留，從而危害人體健康。長期服用含有抗生素的乳品，會導致人體過敏反應、中毒反應和細菌耐藥性[2]。因此，歐盟、日本、澳大利亞等均設定了牛奶中抗生素類藥物的最高殘留限量（MRL），我國農業部也設立了相應標準。

目前，牛奶中抗生素殘留的檢測方法有儀器分析法，微生物檢測法和免疫分析法[3-10]。儀器方法如LC-MS/MS具有準確度高、靈敏度高的優勢，但因設備昂貴，耗時長且需要專業人員操作等因素而限制了其廣泛使用[11]。微生物法如嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法前處理簡單，耗時短，但需要二次確證[12]。免疫分析法基于抗原-抗體的特異性反應，能達到快速準確定性或定量檢測復雜基質中目標物濃度的目的。傳統的非均相免疫反應如酶聯免疫吸附測定（ELISA），化學發光酶聯免疫吸附測定（CLELISA）需要較長的包被孵育時間，繁瑣的洗板過程，以及專業的儀器進行信號測定，且一般只能檢測單一靶標，具有一定的限制性[13-14]。

膠體金免疫層析法具有空間分辨的優勢，可達到同時檢測多種藥物的目的，且成本低廉，操作簡單，能實現快速檢測（一般5~10 min），可通過視覺定性或儀器定量。目前，很多研究團隊相繼報道了利用膠體金免疫層析技術同時檢測多種目標物的方法[15-17]。如Han等建立了可同時檢測牛奶中β-激動劑，磺胺類藥物和四環素類藥物的多條帶膠體金免疫層析法，可在10 min內通過視覺實現藥物半定量檢測[18]。

本試驗以乳品中廣泛殘留的β-內酰胺類（青霉素類和頭孢類）和四環素類抗生素為靶標，建立多重膠體金免疫層析技術，無需前處理，可在8 min內通過視覺定性檢測生乳、純牛奶和奶粉中20種抗生素殘留，為乳品安全的有效監控提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生乳、純牛奶、奶粉，市售；青霉素G、芐星青霉素、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林、頭孢喹肟、頭孢乙腈、頭孢洛寧、頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻呋、頭孢氨芐、四環素、土霉素、金霉素、多西環素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四環素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩諾沙星、牛血清白蛋白（BSA），均購自美國Sigma公司；β-內酰胺類抗原、四環素抗原、頭孢氨芐抗原、β-內酰胺類受體、四環素類單克隆抗體、頭孢氨芐單克隆抗體，均購自北京維德維康生物技術有限公司；氯金酸（三水），購自國藥集團化學試劑有限公司；樣本墊、吸收墊、PVC背板，購自上海金標生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，購自德國Sartorius公司。

1.2 儀器與設備

XYZ3060三維噴點平臺，購自美國Bio Dot公司；CM4000裁切機，購自上海金標生物科技有限公司；Milli-Q超純水系統，購自Millipore公司；Anglent1200型液相色譜-串聯質譜系統，購自美國安捷倫公司；高速冷凍離心機，微量移液器，購自德國Eppendorf公司；精密天平，購自德國Sartorious公司；恒溫磁力攪拌器，德國Heigoph公司；冷凍干燥機FD-1B-50，購自北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠體金制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[19]。在潔凈的燒杯中加入蒸餾水900 mL，添加2%（w·v-1）的HAuCl4（三水）36 mL，加熱至沸騰，邊攪動邊加入1%檸檬酸三鈉溶液79.5 mL，當溶液顏色由黃色變成酒紅色時繼續保持溶液沸騰10 min，然后冷卻至室溫。

1.3.2 金標探針的制備

將膠體金溶液100 mL裝入潔凈燒杯中并置于磁力攪拌器上勻速攪拌，添加K2CO3調整溶液pH至8.5，后逐滴加入10 mL用一級水稀釋的混合抗體/受體（β-內酰胺類受體，四環素類、頭孢氨芐單克隆抗體），攪拌10 min后加入20%（w·v-1）BSA溶液2 mL封閉膠體金上的多余位點，持續攪拌10 min后，在4℃、12 000 r·min-1條件下離心30 min，棄上清，用PBS（5%蔗糖，1%BSA，0.5%吐溫20，pH 7.4）0.02 mol將沉淀超聲復溶至100 mL，將復溶好的金標探針溶液加入到潔凈微孔板中，每孔點樣50 μL，放入真空冷凍干燥機中過夜，將凍干的金標微孔用鋁箔袋密封好，待用[20]。

1.3.3 多重膠體金免疫層析試紙條組裝

β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐三合一試紙條由樣本墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和PVC背板4部分組成。將β-內酰胺類抗原（1.1 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），四環素類抗原（0.5 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），頭孢氨芐（1.2 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），羊抗鼠二抗（1.0 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1）通過劃膜儀包被在NC膜上分別作為三條T線和C線，然后將NC膜置于37℃干燥過夜。樣本墊、NC膜、吸收墊依次重疊2 mm固定在粘性PVC背板上，使用裁切機切成4 mm寬的試紙條，放入鋁箔袋中干燥保存待用。

1.3.4 乳品中β-內酰胺類、四環素類、頭孢氨芐藥物檢測過程

生乳和純牛奶樣本無需前處理，在檢測前充分搖勻即可；奶粉樣本每1.0 g加入8 mL一級水溶解、混勻后進行檢測。吸取200 μL待測樣品于凍干的金標微孔中，小心吹打至紫紅色金標探針完全溶解，將金標微孔置于溫育器中50℃溫育3 min；將試紙條樣本墊端插入微孔，靜置反應5 min，取出試紙條并去掉樣本墊以停止層析反應。根據試紙條T線、C線顏色深淺對比情況判定檢測結果：T線顯色比C線深或與C線相同，檢測結果為陰性；T線顯色比C線淺或沒有顏色，檢測結果為陽性，說明樣品中含有目標藥物，原理如附圖所示，其中T1用于β-內酰胺類的檢測，T1用于四環素類的檢測，T3用于頭孢氨芐的檢測。

附圖 膠體金免疫層析試紙條原理

1.3.5 檢測限

選取經高效液相色譜-串聯質譜法確證的不含β-內酰胺類、四環素類和頭孢氨芐抗生素的陰性生乳，純牛奶和奶粉樣本，添加系列濃度β-內酰胺類、四環素類和頭孢氨芐標準品1~100 μg·L-1，每個濃度系列添加20份樣本并平行測定3次，同時檢測空白樣本做陰性對照，記錄檢測結果。將T1、T2、T3檢測線剛好完全消失的濃度定為檢測限（LOD）。

1.3.6 交叉反應

分別向空白生乳、純牛奶和奶粉中添加青霉素G、芐星青霉素、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林、頭孢喹肟、頭孢乙腈、頭孢洛寧、頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻呋、頭孢氨芐、四環素、土霉素、金霉素、多西環素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四環素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩諾沙星5、10、20、50、100 μg·L-1，用試紙條平行測定3次，并設置陰性對照，記錄檢測結果，判斷該試紙條的特異性。

1.3.7 假陽性率和假陰性率

隨機抽取膠體金試紙條檢測陰性生乳、純牛奶、奶粉樣本150份，對出現陽性結果的樣本重復檢測1次，并經儀器方法復檢，統計假陽性數，計算假陽性率。假陽性率計算公式見式1。

隨機抽取膠體金試紙條檢測β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐陽性添加生乳、純牛奶、奶粉樣品，濃度為對應β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐藥物的LOD，共150份。對可疑陰性樣本重復檢測1次，并經儀器方法復檢，統計假陰性數，計算假陰性率。假陰性率計算公式見式2。

1.3.8 實際樣本適應性

用膠體金免疫層析試紙條和儀器法分別對50份生乳、純牛奶、奶粉盲樣進行對比測定，平行測定3次，比較測定結果。根據SN/T 2050-2008《進出口動物源食品中14種β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐抗生素殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》中所述液相色譜-質譜/質譜法進行操作，方法對生乳、純牛奶、奶粉中β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐的 LOD 為 0.5~10.0 μg·L-1；根據 GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》所述液相色譜-紫外檢測法進行操作，方法對生乳、純牛奶、奶粉中四環素類藥物的LOD為5.0~10.0 μg·L-1。

2 結果與分析

2.1 檢測限驗證

采用系列濃度添加的生乳，純牛奶和奶粉進行膠體金免疫層析試紙條的測試，確定試紙條的檢測限。樣本不含待測藥物時，C線和T線均顯色；樣本中含有待測藥物時，隨著藥物濃度的增加，C線顏色逐漸加深，T線顏色逐漸變淺直到完全消失。試紙條檢測限結果見表1。由表1可知，β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐抗生素快速檢測試紙條在生乳、純牛奶、奶粉中LOD分別為青霉素G 2.0 μg·L-1、芐星青霉素 2.0 μg·L-1、氨芐西林 4.0 μg·L-1、阿莫西林 4.0 μg·L-1、苯唑西林 6.0 μg·L-1、氯唑西林 6.0 μg·L-1、萘夫西林 20.0 μg·L-1、雙氯西林 5.0 μg·L-1、頭孢喹肟 8.0 μg·L-1、頭孢乙腈 18.0 μg·L-1、頭孢洛寧 3.0 μg·L-1、頭孢匹林 13.0 μg·L-1、頭孢哌酮 6.0 μg·L-1、頭孢唑啉 20.0 μg·L-1、頭孢噻呋 50.0 μg·L-1和頭孢氨芐 45.0 μg·L-1；四環素、土霉素、金霉素、多西環素均為5.0 μg·L-1。

表1 試紙條檢測限

2.2 交叉反應

向空白生乳、純牛奶和奶粉中添加16種β-內酰胺類藥物，7種四環素類藥物和4種乳品中常檢出的殘留藥物，驗證該試紙條的特異性。試紙條交叉反應測試結果見表2。

由表2可知，試紙條對16種β-內酰胺類藥物有明顯交叉反應（β-內酰胺類受體可識別15種β-內酰胺類藥物，頭孢氨芐抗體僅可識別頭孢氨芐，對其他β-內酰胺類藥物無交叉反應），對四環素、土霉素、金霉素、多西環素有交叉反應，對其余3種四環素（去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四環素）和卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩諾沙星均無交叉反應。

2.3 假陽性率和假陰性率

使用制備的多重膠體金免疫層析試紙條分別檢測150份陰性空白樣本和150份加標濃度為相應LOD的陽性樣本，測試試紙條的假陽性率和假陰性率，以驗證方法的可行性，結果見表3。結果表明，試紙條對生乳、純牛奶和奶粉樣品檢測假陽性率和假陰性率均為0，重復檢測結果未出現錯誤，符合國家對快檢產品檢測性能要求，證明試紙條具有較好的重復性。

表2 試紙條交叉反應測試結果

表3 假陽性率和假陰性率

2.4 實際樣本驗證

用制備的膠體金免疫層析試紙條和儀器法分別對50份生乳、純牛奶、奶粉盲樣進行測定，比較測定結果。儀器方法按照SN/T 2050-2008《進出口動物源食品中14種β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐抗生素殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》中所述液相色譜-質譜/質譜法以及GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》所述液相色譜-紫外檢測法進行檢測，結果見表4。與儀器方法比較，β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐抗生素快速檢測試紙條檢測結果符合率為100%。

表4 實際樣本檢測

3 結論

本試驗成功建立了一種可同時檢測生乳、純牛奶和奶粉中β-內酰胺類-四環素類-頭孢氨芐抗生素殘留的多重膠體金免疫層析法。乳品樣本無需前處理，直接檢測，整個檢測過程可在8 min內完成，僅通過肉眼可進行定性檢測。該方法對乳品中20種β-內酰胺類和四環素類藥物的LOD均低于中國MRL要求，且具有快速、簡便、成本低、易操作的優勢。膠體金作為一種性質優良、合成簡便的納米材料，同時結合免疫層析空間分辨，快速簡便等優點，成為快速檢測行業中一種強有力的初篩手段，其能夠從源頭、生產到流通各個環節實現乳品的安全檢測，具有重要的經濟價值、社會價值和發展潛力。隨著快速檢測識別、讀數技術的迅速發展，膠體金免疫層析的定性檢測功能將得到逐步完善，實現半定量、定量檢測將成為食品安全快速檢測的發展新趨勢[21]。