超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中苯并咪唑類藥物殘留

吳雯娟，黃 婷，鐘名琴，丁燕玲，羅 燕*

（1.深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000）

苯并咪唑類藥物（BMZs）是人工合成的一類多環(huán)芳香雜環(huán)化合物，因其驅(qū)蟲譜廣、驅(qū)蟲效果好、毒性低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于控制豬、牛、羊的消化道寄生蟲病，目前應(yīng)用較多的BMZs主要有阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑和噻苯咪唑等[1]。過量喂食苯并咪唑類藥物或者在哺乳期或者母雞產(chǎn)蛋期飼用，會導(dǎo)致牛奶、雞蛋、組織和乳制品等食品中殘留該類藥物及其代謝產(chǎn)物，而該類藥在動物試驗(yàn)中表現(xiàn)出致畸與致突變作用，可以通過食物鏈，最終危害到人體健康[2]。因此包括中國、美國、歐盟、日本等國家或地區(qū)都已經(jīng)制訂了BMZs及其代謝物的最高殘留限量（MRL）。《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告》第235號公告規(guī)定苯硫氨酯、芬苯達(dá)唑及奧芬達(dá)唑在牛、馬、豬和羊的肌肉、脂肪、腎中的殘留限量為100 μg·kg-1，肝臟中的殘留限量為500 μg·kg-1，牛奶與羊奶中的殘留限量為100 μg·kg-1[3]。

目前苯并咪唑類藥物的檢測方法主要有生物學(xué)法、免疫學(xué)法、高效液相法、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[1,8-9]。BMZs極性較高，難以氣化，熱穩(wěn)定性差，直接GC分析靈敏度低，并且需要衍生，操作復(fù)雜，因此較少用GC方法測定[4]。文獻(xiàn)報道的動物性食品中BMZs提取方法，大多采用液液萃取方法，提取效率低[5-6]。本文從提取和凈化方法來探討動物性食品中BMZs的樣品前處理方式，采用振蕩和超聲波萃取、Watses PRIME HLB固相萃取柱凈化技術(shù)提取時間短，凈化效果好，解決動物性食品中BMZs樣品前處理難題，建立了豬肉中噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、苯硫氨酯殘留簡便、快速、高效的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取新鮮豬肉，充分絞碎，勻質(zhì)，-20℃避光保存。

1.2 儀器設(shè)備

AB Sciex Triple QuadTM 4500質(zhì)譜儀、NEVAP-24型全自動氮吹儀、多管漩渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3K15冷凍離心機(jī)、Milli-Q Integral 3型超純水儀、奧特賽斯AS系列超聲波清洗機(jī)、Watses PRIME HLB（6 cc，200 mg）固相萃取柱。

1.3 主要試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

乙腈水提取液：乙腈水甲酸（80 20 0.2，V/V/V）。

復(fù)溶液：甲醇水甲酸（10 90 0.09，V/V/V）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、苯硫氨酯均為德國Dr.Ehrenstorfer。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、苯硫氨酯的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成約1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃冰箱中保存。

1.5 試驗(yàn)方法

稱取試樣2.50 g（精確到0.01 g）置于50 mL離心管中，加乙腈水提取液10 mL，漩渦混勻5 min，超聲提取5 min，9 000 r·min-1離心 5 min。取上清液3.5 mL直接過Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg），保持1滴/s速度，收集濾液。準(zhǔn)確移出2.5 mL濾液至15 mL帶刻度離心管內(nèi)，40℃水浴氮?dú)獯抵翞V液少于0.5 mL。殘留液用復(fù)溶液定容至1.00 mL，過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流動相A相為0.1%甲酸水溶液，流動相B相為甲醇，柱溫為40℃，進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：600℃；氣簾氣壓力（CUR）：30 psi；碰撞氣壓力（CAD）：8 psi；霧化氣壓力（GS1）：60 psi；輔助加熱氣壓力（GS2）：65 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2，空白基質(zhì)及添加藥物樣本色譜圖見附圖。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

附圖 空白樣品中添加10.0 μg·kg-1苯并咪唑類藥物的色譜

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取苯并咪唑類藥物（噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、苯硫氨酯）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，添加到5個空白豬肉試樣中，制得濃度分別為10.0、30.0、60.0、300、600 μg·kg-1的各系列空白添加試樣，按1.5試驗(yàn)方法處理試樣，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，各化合物的濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。5種苯并咪唑類藥物基質(zhì)試驗(yàn)的線性為10.0~600 μg·kg-1，峰面積與相應(yīng)回收濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為 r=0.993 6、r=0.998 3、r=0.991 2、r=0.992 1、r=0.999 9。

表3 線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，添加濃度為10.0 μg·kg-1，按照1.5試驗(yàn)方法處理和測定，平行樣本n=6，根據(jù)各樣本檢測值計(jì)算出平均值X及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，再根據(jù)公式檢出限MDL=(k×Sb×C)/X（其中：k為置信因子，一般取3），計(jì)算出噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、苯硫氨酯檢出限分別為4.43、6.12、9.97、5.53和3.74 μg·kg-1。

2.3 回收率測定

用空白豬肉試樣進(jìn)行30.0、100和300 μg·kg-13個水平陽性添加回收實(shí)驗(yàn)，每個水平取6個平行樣，按1.5試驗(yàn)方法處理和測定。噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、苯硫氨酯平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。5種苯并咪唑類藥物在30.0、100和300 μg·kg-13個水平的陽性添加回收率為86.8%~98.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%~11.1%。

表4 方法加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了動物肌肉中5種苯并咪唑類藥物殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法前處理簡單快捷，能有效消除基質(zhì)干擾，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，回收率較好，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測。