MTHFR基因多態性在臺州地區原發性男性不育癥中的研究

徐佳佳，陳文舉，梁玲芝，樓永良

(1.溫州醫科大學檢驗醫學院 生命科學學院，溫州 325000；2.臺州市中心醫院檢驗科，臺州 318000)

目前全世界約有10%～15%的育齡夫婦不育，其中男性因素占50%[1-2]。男性不育病因復雜，遺傳因素是原發性男性不育的主要原因之一。5，10亞甲基四氫葉酸還原酶 (Methylene tetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因位點多態性成為女性不孕的研究熱點[3-4]，而在男性不育中研究較少。MTHFR是葉酸代謝途徑的關鍵酶，突變可造成體內嘌呤嘧啶合成異常及DNA、RNA甲基化異常，造成發育必須的DNA及蛋白質缺陷，因此可導致精子數量、活力、形態等異常，從而發生受精困難或質量低下受精卵形成[5-6]。本文旨在探討MTHFR基因C677T和A1298C位點多態性與原發性男性不育的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年1～7月在臺州市中心醫院就診的的原發性男性不育患者104例，年齡20～54歲；選取同期健康查體的已育男性108例為對照組，年齡19～44歲。

納入標準[7]：(1) 原發性不育組為至少1年未避孕且從未使其配偶妊娠的男性，不育年限1～4年，每例均進行詳細的病史采集和生殖專科檢查，排除引起男性不育的其他因素，如隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發育不全等；女性配偶檢查正常，排除其相關的不育因素，包括婦科檢查、B超和子宮輸卵管造影檢查、女性生殖內分泌激素的檢測；(2)正常生育對照組為男性生殖專科檢查正常、并在近3年育有健康小孩的男性；(3)女性配偶年齡<36歲。所有研究對象均簽署知情同意書。

二、方法

MTHFR基因多態性檢測：采集不育組和對照組男性1～2 ml外周血，EDTA抗凝。用DNA提取試劑盒 (TIANamp Blood DNA Kit DP318，北京天根生化)提取DNA，應用ABI Stepone Plus實時熒光定量PCR儀(應用生物系統公司，美國)、MTHFR基因檢測試劑盒(江西諾德)進行熒光定量PCR，檢測MTHFRC677T和A1298C位點的基因多態性。引物系列見表1。PCR擴增程序：95℃總變性5 min，95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環，72℃延伸10 min。

表1 MTHFR目的基因引物及擴增片段長度

三、統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。各等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

結 果

一、一般資料

參與本研究的104例患者年齡20～54歲，平均年齡(31.56±4.81)歲，為常住6年以上的臺州居民，其中農民21%，工人36%，事業單位人員和公務員43%。所有患者均無隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發育不全等，所有患者常規體檢均正常。對照組為健康查體的108例已育男性，年齡19～44歲，平均年齡(30.58±4.43)歲。

二、MTHFR基因C677T位點基因型頻率及等位基因頻率比較

原發性男性不育組CC、CT、TT型基因頻率分別為34.62%、42.31%和23.08%，TT基因型在原發性男性不育組中分布頻率顯著升高，同時CC基因型在原發性男性不育組中表達頻率顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。此外，T等位基因頻率在原發性男性不育組中顯著高于正常對照組(P<0.05)，相對于純合未突變等位基因C 的相對危險度OR1.313[95%CI(1.029，1.674)](表2)。

三、MTHFR基因A1298C位點基因型頻率及等位基因頻率比較

男性不育組與正常對照組相比，其MTHFR基因A1298C位點基因型頻率構成比均無顯著性差異(P>0.05)；男性不育組的C等位基因頻率與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 MTHFR基因C677T位點基因頻率比較[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 MTHFR基因A1298C位點基因頻率比較[n(%)]

討 論

MTHFR是葉酸代謝途徑的關鍵酶，MTHFRC677T 突變位點在第4 外顯子 677位點上，一個胞嘧啶C變異成為一個胸腺嘧啶T，是目前發現的MTHFR基因最常見的不耐熱錯義突變，可導致酶活性降低。MTHFR基因另一常見多態性 A1298C在調節區的第7外顯子上，A1298C 突變是由胞嘧啶C替代腺嘌呤A，不影響酶的催化活性，主要使酶的調節活性受影響[8]。

MTHFR基因突變可造成葉酸代謝障礙，體內嘌呤嘧啶合成異常及DNA、RNA甲基化異常，造成發育必須的DNA及蛋白質缺陷，在男性易引起精子缺陷。受精過程中，DNA缺陷的精子不易被卵母細胞的透明帶自然識別，造成受精率低下。DNA損傷的精子進人卵子后，其染色質去致密化過程出現障礙，妨礙雄性原核的形成，可導致受精失敗。在胚胎發育過程中，突變基因可使受精卵發育異常，從而導致受精卵著床不穩、胚胎發育異常、 胎兒畸形或胚胎發育停止、流產等。此外，MTHFR基因突變可導致體內具有細胞毒性的同型半胱氨酸(Hcy)水平增高，高Hcy血癥代謝過程中，細胞內產生大量氧自由基，從而使精子核與線粒體DNA損傷，影響精子功能[9]。鄒宇潔等[10]研究發現，MTHFR基因C677T位點多態性可影響精子活力、存活率、DNA完整性及頂體完整性，從而使精子質量下降，導致原發性男性不育的發生。

本研究顯示，臺州地區MTHFR基因C677T位點基因型與等位基因分布與原發性男性不育相關(χ2=6.975，P<0.05)。MTHFR基因C677T位點T等位基因在原發性男性不育組中分布頻率顯著高于對照組，T等位基因是原發性男性不育的危險因素[OR1.313，95%CI(1.029，1.674)]。MTHFR基因A1298C位點基因型與原發性男性不育無相關性(χ2=0.108，P>0.05)。這與Mfady等[11]研究的約旦人MTHFR基因C677T位點與男性不育有顯著相關、A1298C位點基因型與男性不育無顯著相關，Wu等[12]研究的亞洲人C677T突變易發生男性不育而A1298C位點則無明顯影響相一致；與胡斐等[13]研究的C677T 多態性可能與男性少弱精子癥的發生相關相似；但與周生輝等[14]、馬芳芳等[15]研究的MTHFR基因C677T多態性與男性不育無顯著相關不同。另一些研究報告也顯示各種基因型在不育男性和對照組的分布并無差異，認為C677T與男性不育無關[16-17]。這可能與MTHFR基因位點多態性存在一定的地域差異有關。本文研究對象為常住6年以上的臺州地區部分原發性不育男性，具有一定的地域局限性，代表性欠佳，因而MTHFR基因型及等位基因頻率結果可能存在一定的偏差。今后將進行大樣本量研究，使數據更接近真實情況。

通過本研究顯示，檢測育齡男性MTHFR基因位點多態性，與檢測育齡女性MTHFR基因位點多態性同樣具有意義。可根據基因結果進行個體化葉酸補充指導，改善精子結構和功能，減少原發性男性不育的發生。