評估精子濃度常用儀器準確性評價方法研究

王曉尉，谷翊群，周芳，梁小薇，許劍鋒，盧文紅

(國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081)

精液參數是診斷男性疾病、以及治療效果評價的重要指標之一，同時也對評估男性生育力有著重要作用。多年來，精液參數評估方法多、技術要求高，操作很難標準化。因此，各個男科實驗室以及相關機構都對自己的人員進行實驗室操作的內部質量控制，以保證實驗人員操作技術規范、檢驗結果的一致性和準確性。

雖然，各個實驗室對于人員操作技術的規范相當重視，但卻經常忽略相關實驗儀器準確性的校準。誤差的來源并不完全來自于操作者本身，儀器的誤差也是檢測結果誤差的來源之一，尤其是現在各大三甲醫院幾乎都在使用計算機輔助精子分析系統(CASA)，對于儀器的準確性判斷更是勢在必行。

精子濃度一直是精液常規檢測中問題比較大的一個指標。Makler計數板和CASA是實驗室最常用的兩個計數精子的儀器，但是經過長期使用的Makler計數板，其腔室容積會發生變化，CASA對于精子的捕捉是否準確，這些都是我們在實驗中無法預知的，并且這些因素都有可能對我們的實驗結果產生影響。根據《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版手冊相關質控方法的介紹，我們總結了一些評估方法，探討這些方法能否評估儀器的準確性。

資料與方法

一、研究對象

精液樣本：北京人類精子庫20例新鮮志愿者精液樣本。樣本采集見文獻[1]。所有志愿者簽署知情同意書。

混合精液質控品：對收集的液化和粘稠度都正常的精液樣本進行充分混勻后，分裝成10支，每支500 μl，作為濃度的質控樣本。

質控珠：QC-BeadsTM質控珠(Bioscreen，美國)。

二、研究方法

1.精子濃度計數要求：利用改良Neubauer計數板、Makler計數板進行人工分析，以及用CASA進行自動分析。其中利用改良Neubauer計數板計數精子遵循《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版(以下簡稱“第五版”手冊)的要求進行，Makler計數板和CASA計數則遵循儀器使用規范的要求進行計數，CASA計數時所用的載體為自帶的10 μl深計數池。具體實驗操作的技術員必須經過第五版手冊相關技術的培訓，并能夠熟練使用改良Neubauer計數板、Makler計數板以及CASA對精子進行計數。

2.混合精液質控品評估：分別用改良Neubauer計數板、全新購置的Makler計數板(簡稱“新Makler計數板”)和使用超過7年的Makler計數板(簡稱“舊Makler計數板”)進行評估，將改良Neubauer計數板評估的精子濃度值作為標準，分別和新舊Makler計數板所及結果進行比較。

3.質控珠評估：利用新Makler計數板和舊Makler計數板分別對高(53～67×106/ml)、低濃度(25～34×106/ml)質控珠樣本分別進行評估，評估得到的結果與質控珠給定的靶值范圍繪制Youden圖[2]，并對新、舊Makler計數板評估結果進行對比。

4.多份新鮮精液樣本評估：利用改良Neubauer計數板、Makler計數板以及CASA對20份新鮮精液樣本的濃度進行評估，將改良Neubauer計數板評估的濃度值作為標準，所得到的結果繪制Bland-Altman圖[3-4]。

5.評估準確性控制：進行混合精液樣本和質控珠的評估時，為了減少人為因素引入的誤差，每次檢測都要進行兩次計數，并進行差異的一致性檢驗。對每個樣本要進行多次(不少于10次)的檢測。多份新鮮精液樣本的評估[1]，每份樣本檢測都要進行兩次計數，并進行差異一致性檢驗。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。利用單因素方差分析、Youden圖、Bland-Altman圖以及配對t檢驗對新舊Makler計數板以及CASA檢測的濃度結果進行分析，并檢測差異性結果。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同計數板對混合精液質控品的計數結果

統計結果顯示，不同計數板對同一份混合精液質控品的濃度連續檢測結果變異系數(CV)均小于10%；與舊Makler計數板相比，新Makler計數板(P=0.006)和改良Neubauer計數板(P=0.03)均有顯著性差異，而改良Neubauer計數板與新Makler計數板沒有顯著性差異(P=1.0)(表1)。

表1 不同計數板對同一份混合精液質控品連續進行10次評估結果(×106/ml)和單因素方差分析結果

注：與舊Makler計數板相比，*P<0.05

二、質控珠計數結果

統計結果顯示，濃度連續濃度計數結果變異系數(CV)均小于10%，不論是高濃度(P=0.002 5)還是低濃度(P=0.009)，新、舊兩個計數板所評估的結果都有顯著性差異(表2)。根據質控珠給定的靶值范圍，繪制Youden圖，可以看出有部分點偏出了靶值范圍，但是，所有點的分布相對比較集中，散點偏離靶值范圍的距離并不遠(圖2)。

表2 不同計數板對同一份質控珠樣本連續進行10次評估結果(×106/ml)和單因素方差分析

注：與同濃度新Makler計數板相比，*P<0.05

圖1 顯微鏡下改良Neubauer計數板計數質控珠

●圓點代表新Makler計數板評估結果；▲三角代表舊Makler計數板評估結果圖2 新、舊Makler計數板評估質控珠結果的Youden圖

三、20份新鮮精液樣本評估結果

A：改良繪制方法；B：傳統繪制方法圖3 改良Neubauer計數板vs. 舊Makler計數板的精子濃度計數Bland-Altman圖

A：改良繪制方法；B：傳統繪制方法圖4 改良Neubauer計數板vs. CASA精子濃度計數的Bland-Altman圖

對20份新鮮精液樣本計數進行配對t檢驗，結果顯示與改良Neubauer計數板相比，舊Makler計數板沒有顯著性差異(P>0.05)，CASA有顯著性差異(P<0.05)(表3)。驗證了Bland-Altman圖改進方法判斷的準確性。

表3 改良Neubauer計數板、舊Makler計數板和CASA對20份樣本檢測結果(×106/ml)

注：與改良Neubauer計數板相比，*P<0.05

討 論

文中實驗均依據第五版手冊要求進行操作，其中改良Neubauer計數板評估濃度按照第五版計數方法要求完成，Makler計數板和CASA則按照相關規則進行計數，但也要按照手冊要求每次或每個樣本至少計數兩次，并進行一致性分析。

通常男科實驗室進行校準設備所用的質控樣本有兩種，一個是質控珠，另一個是自制的精液質控品。對于兩種質控品對設備準確性評估效果，我們在實驗中做了對比。為保證實驗準確性，我們每個濃度都進行重復10次檢測，以減少實驗人員操作所帶來的誤差。在用自制的混合精液質控品中，以改良Neubauer計數板評估結果作為標準，評估結果進行One-way ANOVA進行分析 (表1)。而質控珠結果也同樣方法進行計數(表 2)，但我們并沒有對比改良Neubauer計數板的結果。首先，質控珠直徑較小，在計數板內長時間不沉降(圖1)，導致無法準確計數。其次，質控珠本身給定了靶值范圍，沒必要再用改良Neubauer計數板計算質控區間。從實驗結果上看，無論是使用質控珠還是自制精液質控品，新、舊Makler計數板計數結果對比都有顯著差異。而用自制精液質控品，新Makler計數板與改良Neubauer計數板計數濃度結果卻沒有顯著差異。陸金春等[17]學者發現在精子濃度分析中，精子計數池的深度非常關鍵，使用不合格的計數板，將導致檢測結果產生誤差，這種誤差和計數板深度誤差成正比。因此我們推斷，Makler計數板長期使用其準確度是有一定變化的。

實驗中我們還發現，由于質控珠給定的靶值范圍偏大，雖然舊Makler計數板計數濃度結果有部分不在靶值范圍內，但新、舊計數板計數結果在Youden圖(圖2)中的點卻很集中，并且超出靶值范圍并不遠，從圖中我們并不能明顯看出兩塊計數板計數結果的差異，但是從統計結果上看(表2)卻有顯著性差異。因此，我們更推薦男科實驗室用自制的混合精液質控品進行Makler計數板的質控。自制質控品成本很低，而且容易獲得，可以利用改良Neubauer計數板做靶值范圍進行質控，但是在使用過程中要注意分裝和取樣時精液要混勻。若需要用質控珠進行評估，必須配合相應的統計學分析，而不能直接使用給定靶值范圍。

Bland-Altman方法是一種介于定量和定性之間的方法，它可以用于判斷兩種方法或兩個人測量結果的一致性。WHO第五版手冊里推薦用此種方法分析和報告2名技術員之間的差異。這種方法最大的好處就是采用圖示的方法，很直觀的顯示出判斷結果。但是，很多人都忽略了Bland-Altman方法是有適用條件的[5]。對于傳統的繪制方法，首先，差值的平均趨勢在測量范圍內保持不變，表現為圖中散點分布與X軸平行；第二，差值的散布程度在測量范圍內保持一致，表現為圖中的散點分布在同寬的離散帶內，即方差齊同；第三，差值的分布呈正態分布[6]。只有滿足這三個條件，我們才能認為數據是良好的。否則直接使用Bland-Altman方法，不但得不到我們想要的真實結果，反而浪費了大量的數據[7，12]。

從上述實驗結果顯示，對于Bland-Altman方法改進是有一定效果的，但是前提是確保我們改進后的方法也要滿足Bland-Altman方法的使用條件，該方法的使用要靈活、要符合本行業的實際情況[13-16]，切不可生搬硬套。

Makler計數板作為男科實驗室常用的手工計數工具，很少有人關注其腔室深度的變化對精子計數結果的影響，而國內只有陸金春等[17]少數學者用Geoffrey精子計數池證明了二者的相關性。但是，實驗只用了質控珠，而沒有用精液樣本，因此，其結果有一定的局限性。我們用兩種質控品進行了對比，用實驗數據更全面的闡述了哪種質控品更適合男科實驗室。CASA對比手工實驗的結果，國內做的很多[18-20]，大多數用統計學軟件進行分析得到結果，雖然結果有說服力，但是不夠直觀，也無法顯示更多細節，例如，有多少組數據偏差比較大，CASA在哪個濃度范圍內測量比較準確等數據。Bland-Altman圖在治療方法和試劑盒檢測結果對比方面應用非常廣泛[13]，但是，在男科領域目前國內很少引用這種方法，盧文紅等[2]將這種方法引入男科實驗室人員質控，而利用這種方法對儀器進行質控和校準的，國內目前還是空白，我們希望通過這些方法能夠為廣大的男科實驗室人員對相應的儀器質控和校準提供方法上的借鑒。