黑色素瘤缺乏因子2炎性小體在心肌梗死后心肌纖維化中的作用

靳文 劉云峰 勞鈺 李冬義 陳潔瓊 劉一炫 趙雅紅

1廣東省第二人民醫院心血管內三科（廣州510317）；2南方醫科大學珠江醫院（廣州510282）

慢性心力衰竭是各種心臟疾病的嚴重表現或終末階段，具有發病率高、致殘率高、病死率高以及反復發作等特點，已經成為世界范圍內危害公眾健康最為嚴重的疾病之一［1-3］。近年來，慢性心力衰竭的治療藥物、方法以及手段已發生顯著變化，突出表現在從傳統的利尿、強心、擴血管等短期血流動力學治療向以神經內分泌調節為主的治療策略轉變［4］。然而，我國慢性心力衰竭的患病率仍然居高不下，主要在于：（1）我國人口老齡化加劇和生活方式轉變以及診療技術的快速進步，急性心肌梗死的發病率逐年升高、存活率獲得改善，顯著促進了慢性心力衰竭發病率升高［4］；（2）心肌梗死后心肌纖維化是慢性心力衰竭的關鍵病理基礎和不良預后的重要影響因素，其發病機制仍未完全闡明［5-6］。炎癥反應廣泛參與慢性心力衰竭的發生和發展［7］。炎性小體是炎性反應的初始傳感器，可能在心肌梗死后心肌纖維化中發揮重要調控作用。本研究通過構建冠狀動脈左前降支結扎術構建心肌梗死后心肌纖維化小鼠模型，旨在探討黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎性小體在心肌梗死后心肌纖維化中的潛在作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組Aim2-/-小鼠由南方醫科大學李杏博士惠贈。Aim2-/-小鼠為C57BL/6品系遺傳背景，本研究以其同窩對照野生型（wild type，WT）小鼠作為對照。本研究嚴格遵守實驗動物倫理規章，嚴格遵循國際實驗動物評估和認可委員會（國際實驗動物飼養評估認證協會）的認證要求，在此基礎上建立小鼠心肌梗死后心肌纖維化模型。本實驗研究已經廣東省第二人民醫院倫理委員會批準。Aim2-/-、WT等小鼠分別予以冠狀動脈左前降支結扎法制備心肌梗死后心肌纖維化小鼠，分為Aim2-/-小鼠組、WT小鼠組，每組20只小鼠。

1.2 冠狀動脈左前降支結扎法建立心肌梗死后心肌纖維化小鼠模型Aim2-/-、WT等小鼠行冠狀動脈左前降支結扎術構建心肌梗死后心肌纖維化模型：行冠狀動脈左前降支結扎術，術后1周即可出現心肌梗死后心肌纖維化。簡要操作如下：小鼠以2%異氟醚吸入誘導麻醉后以1.5%異氟醚維持麻醉。小鼠進入麻醉狀態后固定于手術臺，備皮，消毒，連接心電圖標準Ⅱ導聯。經口氣管插管，予以小鼠呼吸機輔助通氣。手術過程嚴格遵循無菌操作。于第4肋間開胸，在左心耳下1 mm處，用6-0號尼龍縫線結扎冠狀動脈左前降支近段。實時監測心電圖變化。當心電圖出現ST段持續抬高，左前降支支配區域心肌變蒼白，提示小鼠心肌梗死模型制備成功。關閉胸腔，逐層縫合組織以及皮膚，術后予以丁丙諾啡（0.1 mg/kg）腹腔內注射止痛。如有脫水現象，予以腹腔注射適量無菌生理鹽水。腹腔注射青霉素15萬單位×3 d。4周后即可出現顯著的心肌梗死后心肌纖維化。

1.3 小鼠存活率和生命體征監測每日記錄小鼠死亡事件和時間，計算各組小鼠存活率；采用小鼠生命體征監護儀記錄心率、血壓（收縮壓和舒張壓）、呼吸頻率和幅度、血氧飽和度等。連續4周。

1.4 心臟超聲監測小鼠心臟功能各組小鼠均行心臟超聲以監測心臟結構和功能。小鼠胸前備皮、10%水合氯醛麻醉固定，使用IE33彩色超聲檢測儀L15-7io模式（深度2.0 cm，速度60 mm/s），經左室長軸獲2D，改M型模式，M線平行二尖瓣后基底部，以M型超聲測量以下左心室指標：左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心排出量（cardiac output，CO）。每只小鼠在每個切面上檢測2次，每次連續讀取5個心動周期，取平均值。

1.5 Masson染色檢測心肌纖維化常規操作脫蠟；把切片置于Masson染色液泡制4 min；浸泡冰醋酸溶液1 min；置于磷鎢酸染5 min；0.2%冰醋酸洗滌2 min；以亮綠或苯膠藍液復染5 min；再把切片置于0.2%冰醋酸浸洗3次；即予中性樹膠把切片面封閉。顯微鏡下隨機以兩百倍取視野。每個樣本隨機取3～5個視野進行分析。

1.6 Western Blot檢測Western Blot檢測心肌梗死后組織AIM2、TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達，發現左心室梗死區心肌組織AIM2、TGF-1β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達。上述抗體均購買自Abcam公司。測定提取的各組心肌組織細胞總蛋白濃度，制膠，取100 μg各組組織蛋白樣品上樣，電泳，轉膜，用封閉液配制一抗（AIM2、IL-1β、TGF-β、CollagenⅠ）工作液，4℃下與育過夜，次日取膜于室溫下清洗4次，每次5 min。接著以含有二抗的封閉液與膜孵育1 h，室溫下清洗4次，每次5 min。加入化學發光底物，顯影，拍照。使用ImageJ軟件進行檢測條帶灰度值與GAPDH的比值（磷酸化蛋白以磷酸化蛋白灰度值與相應總蛋白灰度值比較）表示各組相應蛋白的表達強度。目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。上述實驗重復3次。

1.7 組織免疫熒光檢測心肌組織IL-1β和CollagenⅠ的表達首先將組織切片烤片、脫蠟、水化，抗原微波修復15 min，PBS清洗3次，37℃下5%BSA封閉40 min后加一抗工作液（IL-1β和CollagenⅠ）4℃孵育過夜后室溫復溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。接著，在37℃、避光情況下，加入二抗工作液孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min。防淬滅封片劑封片，4℃避光保存。最后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，實驗數據以±s表示，兩組間樣本的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Aim2-/-小鼠心肌梗死后生存率和心功能獲得改善生存分析結果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后生存率獲得顯著改善（P＜0.05）。心臟超聲檢查結果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后LVEF和CO增強（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后生存曲線和心功能變化Fig.1 Survival curve and cardiac function changes after myocardial infarction in Aim2-/-and WT mice

2.2 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化減輕Masson染色結果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化程度減輕。見圖2。

圖2 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后心肌纖維化（Masson染色）Fig.2 Myocardial fibrosis after myocardial infarction in Aim2-/-and WT mice（Masson staining）

2.3 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化區域IL-1β和CollagenⅠ表達減輕免疫組織熒光檢測結果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化和缺血纖維化組織中IL-1β、CollagenⅠ表達均減弱。見圖3。

2.4 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達減輕Western Blot 檢測結果顯示：與WT相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化組織中TGF-β、IL-1β、CollagenⅠ表達均減弱。見圖4。

3 討論

AIM2是PHYIN蛋白家族成員，廣泛存在于心肌成纖維細胞（Cardiac fibroblasts，CFs）［8］，主要定位于細胞質，為損傷相關分子模式分子雙鏈DNA、線粒體DNA受體，具有兩個特征性結構域：N端熱蛋白結構域（pyrin domain，PYD）和C端200氨基酸重復序列的造血干擾素誘導核蛋白（hematopoietic interferon-inducible nuclear proteins with 200 amino acid repeats，HIN-200）結構域，主要通過HIN-200結構域特異性識別細胞質中的雙鏈DNA、mtDNA，釋放PYD而招募接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD），形成 AIM2炎性小體（AIM2-ASC-Pro-Caspase-l），依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease 1，Caspase-1）的活化進一步裂解pro-IL-1β、pro-IL-18，產生并分泌IL-1β、IL-18，或裂解gasdermin D（GSDMD），觸發細胞焦亡，分泌IL-1β、IL-18等炎癥因子并釋放至細胞外，快速啟動免疫炎性反應［9］。本研究首次發現Aim2-/-小鼠心肌梗死后存活率和心臟功能（左室射血分數和心排血量）改善（P＜0.05）、心肌纖維化程度減輕，心肌梗死后心肌纖維化組織IL-1β、TGF-β、CollagenⅠ等表達降低，提示AIM2炎性小體參與調控心肌梗死后心肌纖維化，可能是心肌梗死后心力衰竭的重要治療靶點。

炎性小體作為心肌梗死炎癥反應的初始傳感器，在心肌梗死后心肌纖維化中發揮重要調控作用［10］。ASC、Caspase-1是AIM2炎性小體組成和活化的關鍵分子。已有研究［10］發現與野生型小鼠相比，ASC、Caspase-1基因敲除小鼠在心肌缺血再灌注損傷后CFs的增殖和炎癥因子分泌等活性顯著降低，心肌梗死后心肌纖維化改善。其次，IL-1β和IL-18是炎性小體活化后分泌的主要炎癥因子，能夠有效促進CFs功能活化和心肌纖維化［11-12］。以上研究結果提示炎性小體成員ASC、Caspase-1是促進心肌梗死后心肌纖維化的重要分子。AIM2作為模式識別受體和炎性小體家族重要成員，是否促進心肌梗死后心肌纖維化？為此，本研究利用Aim2-/-小鼠及其同窩對照野生型小鼠，采用冠狀動脈左前降支結扎術構建心肌梗死后心肌纖維化模型，觀察小鼠存活狀況。與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的存活率以及心臟功能指標LVEF和CO顯著改善，提示Aim2-/-小鼠能夠改善心肌梗死后心力衰竭。Masson染色結果顯示Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化程度減輕，Western Blot和組織免疫熒光技術檢測結果顯示心肌梗死后心肌纖維化組織CollagenⅠ分子表達降低，提示Aim2-/-小鼠存活率和心臟功能改善與心肌梗死后心肌纖維化減輕密切相關。

圖3 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后正常心肌、心肌梗死纖維化、心肌梗死缺血纖維化等組織中CollagenⅠ和IL-1β的表達Fig.3 Expression of Collagen I and IL-1β in normal myocardium，ischemic myocardial fibrosis and infarcted myocardial fibrosis of Aim2-/-and WT mice after myocardial infarction

心臟固有CFs是構成心肌組織的主要細胞和心臟CFs的最主要來源，遍布于心肌組織，包繞著心肌細胞并與心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）相連接，具有調控ECM代謝、合成分泌多種細胞因子、介導心肌電/機械信號傳導，參與血管新生等功能［13］。由于能夠耐受心肌缺血，CFs在心肌梗死后早期即可迅速對壞死心肌釋放的損傷相關分子模式分子作出反應，直接表現為CFs增殖、遷移、向肌成纖維細胞（cardiac myofibroblasts，CMFs）轉分化、ECM產生等能力增強，間接表現為通過自分泌和旁分泌大量細胞因子［如轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、IL（interleukin，IL）-1β］作用于心肌組織中CFs、心肌細胞、免疫細胞等各種靶細胞［13-14］。TGF-β、IL-1β等是介導CFs功能活化的重要因子。其中，TGF-β主要通過TGF-β-Smad2/3信號通路促進CFs向CMFs轉分化、ECM產生等方式調控心肌梗死后心肌纖維化［15］。IL-1β通過與其受體結合介導 JNK、p-38MAPK、Erk等信號通路激活NF-κB促進CFs的增殖、分化、遷移以及炎癥因子分泌［12，15］。可見，CFs既是心肌梗死后心肌纖維化過程中的主要作用細胞，也是炎癥因子重要來源和靶點，在心肌梗死后心肌纖維化過程中發揮主導作用。本研究中Western Blot和（或）組織免疫熒光技術檢測結果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織IL-1β、TGF-β表達降低，提示Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織CFs的細胞因子分泌功能減退。

圖4 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達Fig.4 Expression of TGF-β，CollagenⅠand IL-1β in myocardial fibrosis tissue of Aim2-/-and WT mice after myocardial infarction

本研究存在的局限性在于針對AIM2炎性小體如何調控TGF-β促進心肌梗死后心肌纖維的機制尚不清楚。在今后的研究中，將通過體內外細胞實驗探討AIM2炎性小體調控心肌梗死后心肌纖維化的分子機制。

綜上，本研究結果提示：AIM2炎性小體是心肌梗死后心力衰竭的重要調控分子，可能與其促進心肌梗死后心肌纖維化的作用密切相關。