丹參酮ⅡA通過Nrf2調(diào)節(jié)ALDOC減輕海馬神經(jīng)元放射性損傷的機制

任陳 李璐 徐艷俠 杜莎莎

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州 510515）

放射治療是目前頭頸部腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的重要治療手段之一，患者在這一治療過程中不可避免地會出現(xiàn)放射性神經(jīng)損傷。隨著診療手段的不斷進步及藥物研發(fā)水平的日益提高，腫瘤患者的預(yù)后及生存時間有了明顯改善，其海馬區(qū)域在放射治療過程中受到不同程度的照射，出現(xiàn)放射性神經(jīng)損傷并導(dǎo)致生存質(zhì)量下降［1-5］，這一現(xiàn)象得到了越來越多的關(guān)注［6-8］。如何減少放療患者的放射性神經(jīng)損傷，成為了一個重要的臨床問題。

前期研究提示，丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA）可能通過調(diào)節(jié)糖酵解及自噬減輕海馬神經(jīng)元放射性損傷［9］，且在動物試驗中也發(fā)現(xiàn)，其對經(jīng)放射線照射后的豚鼠內(nèi)耳毛細胞、血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)均起到一定程度的保護作用［10］，但這一作用的具體機制尚不清楚。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)糖酵解酶ALDOC在放射線聯(lián)合丹參酮ⅡA處理的神經(jīng)元細胞中出現(xiàn)表達改變，并進一步研究相關(guān)調(diào)節(jié)通路，探索丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)糖酵解減輕海馬神經(jīng)元放射性損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞照射試驗分單純對照組（Control）；單純藥物組（Tan）；照射組（RT）；照射+丹參酮ⅡA處理組（RT+Tan）。采用本單位Varian 23EX直線加速器處理細胞，分別給予單次照射6 MV X射線，源皮距100 cm。

1.2熒光定量PCR檢測mRNA表達利用Trizol法提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄（步驟主要參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書），實時熒光定量PCR檢測各組細胞Nrf2、ALDOC的mRNA表達水平。

1.3Western Blot檢測蛋白的表達水平在對數(shù)生長期收集細胞，D-hanks洗滌后加入RIPA裂解液裂解細胞，BSA法檢測蛋白濃度（方法同BSA試劑盒說明書），Western Blot檢測各組細胞糖酵解相關(guān)蛋白ALDOC、LDHA、Glut1，細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、P62表達水平，以β-actin為內(nèi)參。

1.4慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建ALDOC穩(wěn)定高表達及低表達HT-22細胞購買ALDOC過表達及干擾表達病毒液（上海吉凱公司），按照公司慢病毒感染說明書感染HT-22細胞，經(jīng)G418處理后篩選出ALDOC過表達及沉默組細胞，分別為：LV-ALDOC，sh-ALDOC。

1.5MTT法檢測細胞活力在96孔板中分別接種 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，每種細胞設(shè)置3個復(fù)孔，細胞密度約5×103個/孔，細胞貼壁24 h后按照1.1方法照射，照射劑量為 10 Gy，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），4 h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值，分析各組細胞活力。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡6孔板中分別接種 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，細胞貼壁24 h后按照1.1方法照射，照射劑量為10 Gy，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，胰酶（EDTA Free）消化細胞，PE-Annexin-V/7-AAD雙染細胞，流式細胞儀檢測各組凋亡細胞比例。

1.7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染干擾Nrf2的表達培養(yǎng)HT-22細胞，轉(zhuǎn)染前1天細胞傳代至6孔板，細胞密度70%～80%，1 d后按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染si-Nrf2、si-nc質(zhì)粒（上海吉凱公司），48 h后收集細胞按照1.2、1.3方法提取RNA和蛋白質(zhì)。

1.8免疫熒光檢測Nrf2的表達丹參酮ⅡA聯(lián)合放射線照射HT-22細胞后免疫熒光法檢測其Nrf2的表達。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用Bonferroni法（方差齊性），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA促進海馬神經(jīng)元細胞株糖酵解相關(guān)酶ALDOC的表達對海馬神經(jīng)元HT-22細胞加或不加丹參酮ⅡA處理，并予以放射線照射。相對于RT組，RT+Tan組HT-22細胞的糖酵解相關(guān)酶ALDOC在mRNA水平（F=97.488，P＜0.05，組內(nèi)比較：RT vs.RT+Tan，P ＜ 0.05；圖1A）及蛋白水平（圖1B）表達明顯上調(diào)（P＜0.05）。

2.2ALDOC促進糖酵解及自噬調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元放射性損傷利用慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定過表達ALDOC及穩(wěn)定沉默ALDOC細胞株。射線照射后分別檢測HT-22細胞的活力、細胞凋亡比例情況。結(jié)果顯示，ALDOC能顯著提高射線照射后海馬神經(jīng)元HT-22細胞的存活率（F=126.13，P＜0.05）（圖2A），同時降低其凋亡比例（F=98.677，P＜0.05）（圖2B）。反之，穩(wěn)定干擾ALDOC能明顯抑制射線照射后HT-22細胞的細胞存活率（圖2A）。進一步檢測海馬神經(jīng)元細胞HT-22的糖酵解及自噬水平，可見，ALDOC能增加經(jīng)射線照射后的HT-22細胞糖酵解，且促進自噬相關(guān)蛋白的表達（圖2C）。

圖1 丹參酮ⅡA處理后海馬神經(jīng)元HT-22細胞ALDOC表達情況Fig.1 ALDOC expression in hippocampal neurons HT-22 cells treated with tanshinoneⅡA

2.3丹參酮ⅡA通過Nrf2調(diào)控ALDOC的表達為進一步探討丹參酮ⅡA調(diào)節(jié)ALDOC的分子機制，利用PROMO、QIAGEN軟件分析與ALDOC啟動子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，取二者交集，與文獻報道丹參酮ⅡA刺激后上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子再次做交集，發(fā)現(xiàn)Nrf2是ALDOC潛在的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，可見Nrf2及ALDOC在mRNA水平及蛋白水平表達均有明顯上調(diào)（P＜0.05）；隨后干擾Nrf2，ALDOC則隨之受到抑制（P ＜0.05，圖3A、3B）。且通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA處理HT-22細胞后，能上調(diào)Nrf2表達，并使Nrf2從細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核（圖3C）。

圖2 ALDOC對海馬神經(jīng)元HT-22細胞的放射性損傷的作用Fig.2 Effect of ALDOC on radioactive damage of hippocampal neurons HT-22 cells

3 討論

本課題組在既往工作中發(fā)現(xiàn)，ALDOC可能在丹參酮ⅡA減輕海馬神經(jīng)元放射性損傷過程中起到了關(guān)鍵的作用。ALDO是糖酵解過程中的一個重要的酶，對糖酵解的第4步這一可逆性的過程起到了催化作用。其家族有3個成員：ALDOA主要在肌肉中高表達，ALDOB常常在肝臟組織中發(fā)現(xiàn)，而ALDOC主要在腦海馬神經(jīng)元及浦肯野神經(jīng)元中表達［11］。有研究［12］表明ALDOC能與Wnt/βcatenin信號通路相互作用，從而影響細胞分化、大腦海馬回的發(fā)育等。當(dāng)對丹參酮ⅡA處理后的海馬神經(jīng)元HT-22細胞進行照射后，細胞的糖酵解相關(guān)酶以及自噬上調(diào)，生存分?jǐn)?shù)較RT組明顯上升、凋亡減少，考慮丹參酮ⅡA可能通過誘導(dǎo)糖酵解及自噬而對海馬神經(jīng)元起到保護作用，這一作用也在之前的研究中得到證實［9］。在這一過程中ALDOC也出現(xiàn)了明顯的表達上調(diào)。單純上調(diào)ALDOC也能明顯促進糖酵解相關(guān)酶和自噬的表達，細胞存活增加。而抑制丹參酮ⅡA處理后細胞的ALDOC，HT-22細胞在放射線照射后細胞凋亡比例較前增加，細胞糖酵解及自噬均明顯下降。表明丹參酮ⅡA可能是通過調(diào)節(jié)ALDOC的表達來保護海馬神經(jīng)元放射性損傷。

Nrf2是機體內(nèi)一個重要的內(nèi)源性抗氧化因子，在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、細胞生長和凋亡、炎癥反應(yīng)以及泛素介導(dǎo)的降解等方面均有一定的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮能通過激活Nrf2，進一步活化其下游的細胞保護性因子GSH、SOD等，而拮抗神經(jīng)毒素6-hydroxydopamine（6-OHDA）對SHSY5Y細胞線粒體的損傷，從而緩解帕金森病的進展［13-14］，在神經(jīng)保護方面有著顯著作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能促進Nrf2的表達，同時促進其從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)移，而生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Nrf2作為重要轉(zhuǎn)錄因子與ALDOC的啟動子區(qū)結(jié)合，這可能是丹參酮ⅡA通過調(diào)控ALDOC的表達調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細胞放射性損傷的分子通路之一。

圖3 丹參酮ⅡA通過Nrf2促進ALDOC表達Fig.3 TanshinoneⅡA promotes ALDOC expression through Nrf2

自噬能產(chǎn)生降解產(chǎn)物，為生物合成提供底物，為細胞提供能量，具有重要的細胞代謝調(diào)節(jié)能力。當(dāng)放射治療導(dǎo)致細胞能量供應(yīng)缺乏時，為了維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新，給饑餓狀態(tài)下的細胞提供代謝底物以維持生存，包括神經(jīng)元在內(nèi)的大多數(shù)真核細胞能發(fā)生自噬［15-17］。大量信號通路與mTORC1相互作用，從而誘導(dǎo)自噬來抑制細胞生長并減少能量消耗，對抗應(yīng)激狀態(tài)并存活［18-20］。自噬還能清除體內(nèi)過多的過氧化物酶，防止其造成組織損傷，是生存的重要保守功能。丹參酮ⅡA則正可能是通過促進放射線照射的海馬神經(jīng)元細胞糖酵解及自噬的增加，一方面減少能量消耗，另一方面通過糖酵解提供適量的能量，從而保障細胞的基本生長需求，起到放射性損傷的保護作用。

丹參酮ⅡA可能通過多種分子信號通路影響海馬神經(jīng)元的存活，本研究僅在體外試驗細胞層面上初步探索了該藥物可能通過Nrf2調(diào)節(jié)糖酵解酶ALDOC從而引起糖酵解及自噬的改變，促進海馬神經(jīng)元HT-22細胞對放射性損傷的耐受的相關(guān)機制，其在臨床治療過程中的應(yīng)用尚有待于進一步探索。