益氣血法中藥復方對不同促排卵方案小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

陳艷婷 王玉林 袁秋虹 鄧偉民 郭新宇 陳秀華

1廣州中醫藥大學（廣州510405）；2廣州中醫藥大學順德醫院（廣東佛山528333）；3中國人民解放軍南部戰區總醫院（廣州510010）

不同促排卵方案為體外受精-胚胎移植（IVFET）過程中獲取多個卵母細胞創造了可能，促排卵技術成為IVF-ET的關鍵環節而被廣泛應用于臨床。臨床常用的促排卵技術主要是通過使用大量外源性的促性腺激素以促進卵泡數量增多、體積增大，但容易使機體激素水平過高，導致生殖內分泌出現代謝紊亂。研究發現，促排卵導致的雌激素超過了正常的生理水平，這可能會引起顆粒細胞的大量凋亡［1-2］，影響卵母細胞成熟度與核胞漿成熟的同步性［3］，最終影響卵泡質量。目前現代醫學關于促排卵對卵泡質量的影響未找到明確的解決方案，傳統中醫學對此進行了一系列探索［4-5］，但尚未得到公認的研究成果。前期臨床研究發現，中藥益氣血法可提高IVF的胚胎種植率［6］，進一步動物研究發現益氣血法可促進超排卵小鼠卵母細胞分泌因子（OSFs）的表達［7］，OSFs具有維持顆粒細胞低凋亡率的作用，因此，推測益氣血法通過促進OSFs的表達以抑制顆粒細胞凋亡從而改善卵泡質量，提高胚胎種植率。為進一步研究益氣血法改善卵泡質量的作用機制，本研究通過模擬臨床常用的促排卵方案建立小鼠模型，并加以益氣血法中藥復方進行干預，比較各組小鼠卵巢顆粒細胞關鍵凋亡因子在中藥治療前后的變化，觀察中藥復方對不同促排卵方案小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料經后增殖方（劑型：顆粒劑，由一方制藥有限公司提供，產品批號：Q1708003）。促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，醋酸曲普瑞林注射液，瑞士輝凌公司，批號：K18565B）；促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH-ant，注射用醋酸西曲瑞克，法國Pierre Fabre公司，批號：H20140476）；注射用血促性素（又名孕馬血清促性腺激素，PMSG，以色列prospecbio公司，批號：HOR-272）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠藥業有限公司，批號：170704）。

Anti-FAS抗體（1∶1 000，產品批號：ab82419，由英國劍橋Abcam公司提供），Anti-FasL抗體（1∶1 000，產品批號：af 0157，由美國俄亥俄州affnity Biosciences公司提供），Anti-caspase-8抗體（1∶1 000，產品批號：ab25901，由英國劍橋Abcam公司提供），Anti-caspase-3抗體（1∶1 000，產品批號：bs-0081R，由中國北京博奧森生物技術有限公司提供），山羊抗兔IgG抗體（1∶10 000，產品批號：111-035-003，由美國賓夕法尼亞Jackson公司提供），逆轉錄試劑盒（產品批號：DBI-2220，由德國DBI公司提供），熒光定量PCR試劑盒（產品批號：AOPR-1200，由美國Genecopoeia公司提供），BCA蛋白定量測定試劑盒（產品批號：FD2001，由中國杭州弗德生物科技有限公司提供）。

1.2動物及分組SPF級KM雌性小鼠80只，6～8周齡，體質量20～25 g（來自中國人民解放軍南部戰區總醫院動物實驗中心，實驗小鼠合格證號：44007200046941）。小鼠均給予自然飲水及飼料喂養1周，1周后按隨機數表法隨機分為8組，每組10只。各促排卵組分別為：孕馬血清促排卵組（PMSG組）、促性腺激素釋放激素激動劑促排卵組（GnRH-a組）、促性腺激素釋放激素拮抗劑促排卵組（GnRH-ant組）、自然排卵組（空白對照組），共4組；各益氣血法中藥復方干預組分別在各促排卵方案的基礎上給予中藥灌胃處理，分別為：PMSG+中藥組、GnRH-a+中藥組、GnRH-ant+中藥組、空白對照+中藥組，共4組。

1.3動物干預及處理GnRH-a組：小鼠根據陰道涂片結果確定為動情后期（即為動情周期第3天）時開始造模，具體為：每日9：00 am采用腹腔注射的方式注射20 μg/kg的醋酸曲普瑞林注射液，連續注射9 d，第9天同時腹腔注射PMSG 400 U/kg，于注射PMSG 48 h后腹腔注射HCG 1 000 U/kg。同時給予臨床等效劑量的生理鹽水灌胃（劑量為1.5 mg/kg），1次/d，連續11 d。GnRH-ant組：GnRH-ant組小鼠以醋酸西曲瑞克注射液400 U/kg代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組。PMSG組：PMSG組小鼠以等體積生理鹽水代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組?？瞻讓φ战M：空白對照組小鼠每日給予等體積生理鹽水腹腔注射，連續11 d，灌胃操作同GnRH-a組。GnRH-a+中藥組：于GnRH-a組處理的基礎上以經后增殖方顆粒劑代替生理鹽水灌胃。GnRH-ant+中藥組：于GnRH-ant組處理的基礎上以經后增殖方顆粒劑代替生理鹽水灌胃。PMSG+中藥組：于PMSG組處理的基礎上以經后增殖方顆粒劑代替生理鹽水灌胃。空白對照+中藥組：于空白對照組處理的基礎上以經后增殖方顆粒劑代替生理鹽水灌胃。

上述8組小鼠于最后一次腹腔注射（HCG或生理鹽水）2 h后經頸椎脫臼處死，收集小鼠雙側卵巢組織，其中一側卵巢經4%多聚甲醛固定，另一側卵巢置于-80℃冰箱凍存。

1.4檢測指標與方法

1.4.1qPCR檢測各組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA的表達根據TRIzol試劑盒操作要求從卵巢組織中提取總RNA；將總RNA依照逆轉錄試劑盒操作要求轉化為cDNA；使用熒光定量PCR檢測試劑盒進行PCR反應，具體反應條件為：95℃10 min，95℃10 s（40個循環），55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s。用 2-ΔΔCt法計算Fas mRNA、FasL mRNA、caspase-8 mRNA、caspase-3 mRNA的水平。具體引物序列如下：Fas上游引物：5′-GCTGGGCAGATGTCTGATATT-3′；Fas下游引 物 ：5′-CCCAAGACGTGTACTCTTTCTAC-3′；FasL上游引物：5′-CTGTGGCTACCGGTGATATTT-3′；FasL下游引物：5′-GTTCTGCCAGTTCCTTCTGT-3′；caspase-8 上游引物：5′-CTGACTGGCGTGAACTATGA-3′；caspase-8下游引物：5′-CATCAGTTAGGAGGGAAGAAGAG-3′；caspase-3上游引物：5′-CCACGGAATTTGAGTCCTTCT-3′；caspase-3下游引物：5′-CCACTCCCAGTCATTCCTTTAG-3′。

1.4.2Western Blot檢測各組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白表達量將各組小鼠卵巢組織懸浮于RIPA裂解液中，根據BCA蛋白定量檢測試劑盒操作要求測定總蛋白濃度；轉膜，加一抗，4℃過夜，加入二抗，室溫下孵育30 min；用ECL法顯影曝光。運用Image J 1.8.0分析條帶的光密度值（OD）。

1.5統計學方法數據運用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，對各組小鼠檢測到的基因及蛋白數據以均數±標準差表示，所有數據均符合正態分布且方差齊，中藥治療前后的兩組小鼠基因及蛋白的水平比較采用t檢驗，多個組別間小鼠基因及蛋白的水平比較用方差分析，組間的多重比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相對表達水平各組小鼠經不同促排卵方案處理后，顆粒細胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平由高到低分別為：GnRH-a組/GnRH-ant組＞空白對照組＞PMSG組。其中，GnRH-a組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平顯著高于空白對照組（均P＜0.01）；GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細胞FasL、caspase-8 mRNA表達水平顯著高于空白對照組（均P＜0.01），Fas、caspase-3 mRNA表達水平與空白對照組相比差異無統計學意義（P=0.85，P=0.51）；PMSG組小鼠卵巢顆粒細胞凋亡因子Fas、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平顯著低于空白對照組（均P＜0.01），FasL mRNA表達水平雖低于空白對照組，但差異無統計學意義（P=0.64）。

中藥干預后，各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平均降低。其中，PMSG+中藥組較PMSG組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平均顯著降低（P=0.01，P＜ 0.01，P=0.03，P＜ 0.01）；GnRH-a+中藥組、GnRH-ant+中藥組分別較GnRH-a組、GnRH-ant組小鼠顆粒細胞 Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表達水平均顯著降低（均P＜0.01）；空白對照 +中藥組Fas、FasL、caspase-8 mRNA表達水平較空白對照組明顯降低（均P＜0.01），caspase-3 mRNA水平也較空白對照組降低，但差異無統計學意義（P=0.13）。見表1。

2.2各組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量各組小鼠經不同促排卵方案處理后，顆粒細胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量由高到低分別為：GnRH-a組/GnRH-ant組＞空白對照組＞PMSG組。其中，GnRH-a組和GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量顯著高于空白對照組（均P＜0.05）；PMSG組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量雖低于空白對照組，但差異無統計學意義（P=0.62，P=0.87，P=0.48，P=0.45）。

表1 各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相對表達水平Tab.1 Expression levels of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 mRNA in granulosa cells of mice ±s

表1 各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相對表達水平Tab.1 Expression levels of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 mRNA in granulosa cells of mice ±s

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；PMSG組vs.PMSG+中藥組，aP＜0.05，aaP＜0.01；GnRH-a組vs.GnRH-a+中藥組，bbP＜0.01；GnRH-ant組vs.GnRH-ant+中藥組，ccP＜0.01；空白對照組vs.空白對照+中藥組，dP＜0.05，ddP＜0.01

組別PMSG組GnRH-a組GnRH-ant組空白對照組中藥干預后PMSG+中藥組GnRH-a+中藥組GnRH-ant+中藥組空白對照+中藥組Fas 0.18±0.07##0.99±0.25##0.45±0.15 0.44±0.18 0.11±0.05a 0.18±0.07bb 0.07±0.03cc 0.23±0.07d FasL 0.15±0.05 0.90±0.29##1.25±0.40##0.21±0.07 0.08±0.02aa 0.45±0.10bb 0.27±0.04cc 0.10±0.02dd caspase-8 0.76±0.26##1.45±0.24##1.45±0.18##1.11±0.15 0.52±0.17a 0.42±0.12bb 0.34±0.08cc 0.30±0.10dd caspase-3 0.65±0.19##5.48±1.65##2.86±0.82 2.55±0.67 0.35±0.15aa 1.55±0.44bb 0.20±0.06cc 2.00±0.78

中藥干預后，各組小鼠顆粒細胞中Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量均降低。其中，PMSG+中藥組較PMSG組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低（P=0.03，P=0.04，P＜ 0.01，P=0.04）；GnRH-a+中藥組較GnRH-a組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低（P＜ 0.01，P=0.02，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；GnRH-ant+中藥組較GnRH-ant組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 蛋白相對表達量均顯著降低（P=0.01，P=0.01，P＜ 0.01，P=0.04）；空白對照+中藥組Fas、caspase-8蛋白相對表達量較空白對照組明顯降低（均P＜0.01），FasL、caspase-3蛋白相對表達量雖低于空白對照組，但差異無統計學意義（P=0.30，P=0.35）。見表2、圖1。

表2 各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量Tab.2 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice ±s

表2 各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量Tab.2 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice ±s

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；PMSG組vs.PMSG+中藥組，aP＜0.05，aaP＜0.01；GnRH-a組vs.GnRH-a+中藥組，bP＜0.05，bbP＜0.01；GnRH-ant組vs.GnRH-ant+中藥組，cP＜0.05，ccP＜0.01；空白對照組vs.空白對照 +中藥組，ddP ＜0.01

組別PMSG組GnRH-a組GnRH-ant組空白對照組中藥干預后PMSG+中藥組GnRH-a+中藥組GnRH-ant+中藥組空白對照+中藥組Fas/β-actin 0.47±0.05 0.70±0.06##0.76±0.12##0.50±0.02 0.36±0.04a 0.31±0.03bb 0.51±0.04c 0.31±0.05dd FasL/β-actin 0.48±0.05 0.79±0.06#0.72±0.05#0.50±0.22 0.40±0.02a 0.58±0.07b 0.48±0.09c 0.33±0.10 caspase-8/β-actin 0.50±0.03 0.78±0.10##0.86±0.09##0.54±0.07 0.29±0.06aa 0.38±0.05bb 0.42±0.09cc 0.25±0.04dd caspase-3/β-actin 0.38±0.04 0.79±0.05##0.70±0.12##0.43±0.05 0.31±0.03a 0.51±0.02bb 0.47±0.05c 0.38±0.06

圖1 各組小鼠顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相對表達量Fig.1 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice

3 討論

促排卵方案主要是通過使用超出生理劑量的人為激素使卵巢的功能得到增強，促進多個卵子同時發育，進而為提高IVF-ET的胚胎種植率及臨床妊娠率提供更多的可能。但促排周期獲得的卵泡與自然排卵周期獲得的卵泡，不同狀態下卵泡質量是否有差別，是值得思考的問題。卵泡作為卵巢的基本功能單位而存在，其發生發育與顆粒細胞的增殖分化關系密切。卵泡的生長依賴于卵泡刺激素（FSH）和促黃體生成素（LH）的共同作用，而顆粒細胞上含有FSH和LH的受體，因此顆粒細胞的發育能力直接影響卵泡的發育和閉鎖。顆粒細胞可通過各種途徑分泌雌二醇和類胰島素樣生長因子等，而這些因子是卵泡發育成熟不可或缺的，若這些主要營養因子出現缺失，則顆粒細胞喪失其功能并發生凋亡，相應地影響卵泡的功能［8］。研究［9-10］發現，顆粒細胞的過度凋亡會使得卵母細胞質量下降，進而卵泡的生長發育過程發生變化，最終影響胚胎的發育潛能及及其質量。研究［11-14］表明，細胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機制。細胞凋亡機制非常復雜，Fas通路是經典細胞凋亡通路之一，哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡的關鍵通路之一就是由Fas介導的凋亡信號通路引發的［15-17］，該通路涉及的主要凋亡因子有4個，分別為Fas、FasL、caspase-8、caspase-3，該路徑的活化是細胞發生不可逆凋亡的重要標志。

目前常用的促排卵方案主要有：GnRH-a方案、GnRH-ant方案、PMSG方案。研究［18-19］表明，GnRH-a方案與GnRH-ant方案均可導致大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的發生。臨床研究［20］發現，卵巢儲備功能正常的婦女給予GnRH-a與GnRH-ant兩種不用的促排卵方案，其顆粒細胞的凋亡率是相當的，兩組間凋亡率差異無統計學意義。本研究中，經GnRH-a與GnRH-ant方案干預后，小鼠卵巢顆粒細胞4個關鍵凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白的表達較空白對照組均升高，表明GnRH-a方案與GnRH-ant方案可導致小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡。PMSG具有FSH和LH兩種生物活性，于月經周期的卵泡期使用人為的FSH可抑制卵泡細胞發生凋亡現象，并且可促進卵子的蛋白質合成［21］，有利于卵泡發育成熟，進而可增強卵母細胞生長發育的能力［22］。研究表明［23］，PMSG具有抑制卵泡閉鎖以及顆粒細胞凋亡的作用。本研究中PMSG組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白表達較空白對照組降低，表明PMSG方案可抑制顆粒細胞的凋亡，與以上研究結果基本一致。

中醫認為：“女子以血為本，以氣為用”。由此可見，氣血對女性生理病理的重要性。腎蘊藏生殖之精，而精與血有著同源且互相滋生的關系，二者是月經來潮的重要條件。精又可生氣，機體腎精所化之氣為“腎氣”，腎中精氣充盛，精血充盈，月經來潮，具備生育的基本條件。因此，本研究提出從益氣血兼補腎的角度治療婦科疾病。益氣血法主方為經后增殖方，全方以四君子湯加四物湯組成補益氣血的主藥，另加菟絲子、山萸肉，兩味藥物均可滋陰補腎，加以具有溫腎助陽功效的杜仲、鹿角膠、蜀椒，達到陽中求陰的功效。使藥為炙甘草，具有調和藥性的功效，并且與以上藥物合用取其甘溫生陽的效果。以上藥物配伍使用，使全方具有氣血俱補的功效，經后增殖方可促進機體氣旺血盛，沖任二脈得以滋養，陰陽達到調和的狀態，為攝精受孕準備了良好的條件。經后增殖方用于月經周期中的經后期，全方氣血俱補，對卵子質量及臨床妊娠率的提高有較好的療效。本研究中，益氣血法主方經后增殖方干預后，各組小鼠卵巢顆粒細胞中 Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白的表達均下降，其中PMSG+中藥組、GnRH-a+中藥組與GnRH-ant+中藥組較PMSG組、GnRH-a組與GnRH-ant組各凋亡因子基因及其蛋白表達水平顯著降低，說明中藥經后增殖方可對臨床常用的促排卵方案導致的卵巢顆粒細胞的凋亡均有一定的遏制作用，并且服用中藥經后增殖方有助于改善小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的情況，使其達到或接近正常排卵狀態。同時，益氣血法主方經后增殖方對自然排卵小鼠的顆粒細胞凋亡也有明顯的抑制作用，表明益氣血法中藥復方不僅可抑制促排卵小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，對正常排卵小鼠也具有抑制凋亡的作用。

綜上所述，益氣血法中藥復方可下調不同促排卵方案小鼠卵巢顆粒細胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及蛋白的表達，改善不同促排卵方案小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡狀態。前期研究［24］表明，益氣血法主方經后增殖方可促進超排卵大鼠卵母細胞分泌因子GDF9與BMP15的表達，GDF9與BMP15具有維持卵巢顆粒細胞低凋亡率的作用。因此，推測益氣血法可能是通過提高GDF9與BMP15的表達，抑制顆粒細胞的凋亡，達到改善卵母細胞質量的作用。本研究中益氣血法主方經后增殖方為中藥復方，藥物組成較多，起主導作用的中藥成分目前尚未進行篩選研究，有待將來進一步深入研究。