NCAPH、AXL和YAP在喉癌中的表達及與預后的關系

黃永陽 張超 周延輝

河南科技大學臨床醫學院，河南科技大學第一附屬醫院耳鼻喉科（河南洛陽471000）

非染色體結構維持蛋白凝縮蛋白復合體Ⅰ亞單位 H（Non-SMC condensinⅠcomplex subunit H，NCAPH）是多蛋白組成的蛋白復合體，屬于Barr家族成員，在有絲分裂和減數分裂過程中對染色體的組裝和染色體的分離發揮重要作用，參與調節染色體的分離及拓撲異構酶Ⅱ的活性［1］。AXL屬于受體酪氨酸激酶家族，參與細胞黏附、促增殖、抗凋亡及細胞轉化等各種生命活動的調節過程［2］。Yes結合蛋白（YAP）是Hippo信號通路的轉錄共激活因子，在器官生長、組織再生、細胞增殖等中具有關鍵調控作用［3-4］。研究［5-7］顯示，NCAPH、AXL和YAP與多種腫瘤的發生、發展以及患者的臨床預后密切相關。

目前，國內外關于NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達及與喉癌預后關系的相關研究尚未見報道。本研究著眼于初步了解NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達，探討NCAPH、AXL和YAP的表達與喉癌發生、發展及浸潤轉移的關系，研究聯合檢測NCAPH、AXL和YAP在預測患者術后復發、評估遠期生存中的指導意義，以期明確聯合檢測NCAPH、AXL和YAP可以作為一組新的喉癌預后判斷、復發監測的客觀指標。

1 資料及方法

1.1一般資料收集河南科技大學第一附屬醫院景華院區2012年10月至2013年6月喉癌患者術后組織蠟塊標本40例作為實驗組，同時期聲帶息肉患者術后組織蠟塊標本40例作為對照組。納入標準：（1）術前活檢及術后病理均提示喉鱗狀細胞癌；（2）均為首發病例，術前均未行任何喉癌相關治療；（3）未患有其他惡性腫瘤和影響本研究結果的其他疾病；（4）所有喉癌患者術后均依照當時最新美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）標準給予正規的化療、放療；（5）臨床病例資料及術后隨訪資料完整可靠。本研究中所有納入對象都是男性，在收集病例標本時有2名女性罹患喉癌，但因不符合本實驗納入標準而被排除在外。所收集喉癌患者年齡32～87歲，平均59.78歲，中位年齡58.5歲。40例喉癌按照美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版TNM分期為Ⅰ期18例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。其中有淋巴結轉移11例，無淋巴結轉移29例；高分化25例，中分化11例，低分化4例；聲門上型10例，聲門型26例，聲門下型4例。

1.2主要試劑即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物，NCAPH多克隆抗體（克隆號Ag2076，1∶100稀釋）、YAP多克隆抗體（克隆號Ag4510，1∶100稀釋）均購于武漢三鷹生物有限公司，AXL多克隆抗體（克隆號558，1∶100稀釋）購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.3免疫組化步驟石蠟切片烤片、脫蠟、水化，自來水沖洗、蒸餾水浸泡，檸檬酸鹽高壓修復，PBS沖洗，3%H2O2室溫孵育阻斷過氧化物酶，滴加5%BSA室溫孵育進行封閉，滴加一抗4℃過夜，室溫放置30 min PBS沖洗，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.4結果判定喉癌組織中NCAPH陽性表現為腫瘤細胞胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒，AXL陽性表現為腫瘤細胞胞漿和胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒，YAP陽性表現為細胞漿和細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒。100×光鏡下挑選腫瘤實質區域，200×光鏡下隨機挑選5個視野。根據染色強度評分：陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強陽性=3。陽性染色細胞數分級為：≤10%（陰性 =0），11% ～30%（弱陽性 =1），31% ～50%（中等陽性=2），＞50%（強陽性 =3）。當兩者得分之和≥3時判定為高表達，得分＜3時判定為低表達［8］。

1.5統計學方法運用SPSS 21.0統計學軟件分析，蛋白表達和喉癌臨床病理特征的關系采用χ2檢驗、Fisher′s精確檢驗，相關性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，繪制生存曲線，并用Log rank test方法進行統計學檢驗，統計結果P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1NCAPH、AXL和YAP在喉癌和聲帶息肉組織中的表達本研究中NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的高表達率明顯高于聲帶息肉組織（圖1～3），差異有統計學意義（P ＜0.05），見表1。

2.2喉癌組織中AXL、YAP和NCAPH在不同臨床病理參數中的表達本研究40例喉癌組織中AXL、YAP和NCAPH的表達與臨床病理參數中的臨床分期、淋巴結轉移、組織分化程度有關（P＜0.05），在年齡、解剖分區的差異無統計學意義（P ＞0.05），見表2。

2.3AXL、YAP和NCAPH蛋白在喉癌組織中表達的相關性分析本研究40例喉癌組織中，AXL與YAP在喉癌中兩者共高表達者18例，共低表達者10例，卡方檢驗分析，χ2=5.736，P=0.017（P ＜0.05），說明喉癌組織中AXL與YAP的表達差異有統計學意義，用spearman法行相關性分析，相關系數r=0.379，P=0.016（P＜ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達有相關性，呈正相關。

圖1 NCAPH在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達（SP，200×）Fig.1 Expression of NCAPH in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

圖2 AXL在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達（SP，200×）Fig.2 Expression of AXL in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

圖3 YAP在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達（SP，200×）Fig.3 Expression of YAP in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

表1 NCAPH、AXL和YAP在喉癌及聲帶息肉組織中的表達之間的關系Tab.1 Relationship between expression of NCAPH，AXL and YAP in laryngeal carcinoma and vocal cord polyps 例

表2 喉癌組織中AXL、YAP、NCAPH蛋白表達與臨床因素之間的關系（Fisher's精確檢驗）Tab.2 Relationship between AXL，YAP and NCAPH protein expression and clinical factors in laryngeal carcinoma tissues（Fisher′s exact test） 例

本研究40例喉癌組織中，AXL與NCAPH在喉癌中兩者共高表達者12例，共低表達者12例，卡方檢驗分析，χ2=2.072，P=0.151（P＞ 0.05），說明喉癌組織中AXL與NCAPH的表達差異無統計學意義，用spearman法行相關性分析，相關系數r=0.228，P=0.158（P＞ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達相關性無統計學意義。

本研究40例喉癌組織中，YAP與NCAPH在喉癌中兩者共高表達者12例，共低表達者10例，卡方檢驗分析，χ2=0.825，P=0.364（P＞ 0.05），說明喉癌組織中YAP與NCAPH的表達差異無統計學意義，用spearman法行相關性分析，相關系數r=0.144，P=0.377（P＞ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達相關性無統計學意義。

2.4 AXL、YAP和NCAPH在喉癌組織中的表達與預后的關系本研究40例喉癌患者，5年隨訪仍存活31例，死亡7例，失訪2例，5年生存率77.5%。本研究將總生存時間作為患者預后狀況的評估指標。總生存時間事件包括所有原因所導致的患者死亡，但本研究中所納入病例患者均因喉癌及其并發癥導致死亡，未出現患者因其他原因死亡的情況。

23例AXL高表達的喉癌患者中，存活15例、死亡6例、失訪2例，17例AXL低表達的喉癌患者中存活16例，死亡1例，用Kaplan-Meier法進行生存分析，χ2=2.782，Plog-rank=0.095（P＞ 0.05），提示AXL的高表達與喉癌患者的生存狀況的差異無統計學意義。

25例YAP高表達的喉癌患者中，存活17例、死亡7例、失訪1例，15例YAP低表達的喉癌患者中存活14例，失訪1例，用Kaplan-Meier法進行生存分析，χ2=4.806，Plog-rank=0.028（P＜ 0.05），提示YAP的高表達與喉癌患者的生存狀況的差異有統計學意義，說明YAP的表達與喉癌患者的預后有相關性。

17例NCAPH高表達的喉癌患者中，存活9例、死亡6例、失訪2例，23例NCAPH低表達的喉癌患者中存活22例，死亡1例，用Kaplan-Meier法進行生存分析，χ2=6.761，Plog-rank=0.009（P＜ 0.05），提示NCAPH的高表達與喉癌患者的生存狀況的差異有統計學意義，說明NCAPH的表達與喉癌患者的預后有相關性。

2.540例喉癌患者預后因素的COX模型分析調用COX回歸過程，擬合COX比例風險模型，分別分析NCAPH、AXL、YAP的表達情況對40例喉癌患者生存期的影響。篩選后的模型，只有NCAPH一個協變量，提示NCAPH的表達對患者的生存期有影響（χ2=8.680，P=0.002＜0.05）。擬合COX比例風險模型P=0.018＜0.05，說明NCAPH在喉癌中的表達強度為影響喉癌患者預后的獨立因素，相對危險度HR=0.078，說明NCAPH高表達的患者死亡風險為NCAPH低表達患者的0.078倍，HR的可信區間（95%CI）為0.009～0.651。

3 討論

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，約占每年新發腫瘤的2.4%，常見的病理類型為鱗狀細胞癌，約占95%以上［9］。盡管治療方法不斷改進，喉癌的發病率仍有增多趨勢，復發亦較常見，嚴重危害人類健康。目前還沒有特異性的指標用于喉鱗狀細胞癌的診斷和預后監測。在分子水平上對喉癌的發生、發展機制及預后關系的研究，有助于喉癌診治水平的提高，加強患者預后的評估，提高患者的術后生存質量，已成為近幾年的研究熱點。近年來，分子與基因標志物在惡性腫瘤的診斷、侵襲與預后的預測等方面的應用日益受到重視。研究發現許多分子標志物包括腫瘤相關抗原、細胞黏附與細胞外基質降解相關的分子、腫瘤血管生成相關的分子等與喉癌的發生、發展及侵襲性具有相關性，某些蛋白的表達改變可以預測喉癌的預后。

本研究顯示，NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的高表達率明顯高于喉良性病變組織，提示NCAPH、AXL和YAP可能參與喉癌的發生發展過程。本研究顯示NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達與喉癌的臨床分期、淋巴結有無轉移、組織分化程度有關，與年齡、解剖分區無相關性。提示NCAPH、AXL和YAP可能參與了喉癌的侵襲、轉移過程。本研究顯示AXL與YAP在喉癌組織中的表達存在正相關，提示AXL與YAP在喉癌組織中的表達可能存在正性調控作用。本研究顯示NCAPH和YAP在喉癌中的表達強度與喉癌的預后相關，NCAPH和YAP高表達提示較差的臨床預后。這與其他實驗研究結果3種目標蛋白在癌組織中的高表達率高于良性病變組織及正常組織一致［10-14］。隨訪研究顯示，本研究40例喉癌患者，5年生存率77.5%。這與國內外關于喉癌生存率的報道基本一致［15］。

本研究顯示AXL的表達與喉癌患者的預后差異無統計學意義，但仍不能否認AXL與喉癌的臨床預后有關。本研究通過COX比例風險模型分析顯示NCAPH在喉癌中的表達強度為影響喉癌患者預后的獨立因素，相對危險度HR=0.078，提示NCAPH高表達的患者死亡風險為NCAPH低表達患者的0.078倍。HR的計算不僅考慮了終點事件的有無，還考慮了到達終點所用的時間及截尾的數據。本研究得出的HR值較小及AXL的表達與喉癌患者的預后差異無統計學意義，考慮有幾方面的影響：（1）本次研究的隨訪時間較短，而喉癌的5年生存率較高，研究中獲得的隨訪數據存在一定程度的誤差；（2）本次實驗研究樣本量較少，需要更大的樣本量來證實以及獲取更加準確的研究數據。

NCAPH、AXL和YAP參與腫瘤發生、發展及預后的機制暫未明確。有研究顯示，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）致癌蛋白E7可以通過E2F1上調NCAPH的mRNA及蛋白水平，E2F1可作為轉錄因子作用于NCAPH的啟動子區，從而激活NCAPH的表達［5］，而HPV感染是目前研究最為廣泛的喉部鱗狀細胞癌感染性因素［16-18］。研究還顯示，敲低NCAPH可以明顯抑制上皮向間質轉化，NCAPH可能是通過上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）機制來影響癌細胞的遷移及侵襲能力［5］。在EMT過程中，腫瘤細胞獲取間質特點并失去上皮特性，導致細胞的黏附能力降低，從而使細胞的侵襲轉移能力增強［19-21］。有研究認為，癌細胞中過表達的AXL能夠導致基質金屬蛋白酶MMP-9基因的表達，造成基底膜和細胞外基質的分解，從而介導癌細胞的侵襲和轉移。有研究提示AXL是EMT的下游效應器，能使細胞的侵襲轉移能力增強。YAP是Hippo信號通路的轉錄共激活因子。Hippo信號通路調控抵抗失巢凋亡、促進細胞惡性轉化、EMT等各種生化過程的分子機制是當前腫瘤生物學研究的前沿熱點［22-24］。這提示3種目標蛋白在喉癌組織中的表達強度均與EMT機制有關聯，NCAPH、AXL和YAP可能是通過多種途徑聯合作用參與腫瘤的發生、發展及預后。

綜上所述，本研究通過檢測喉癌組織和喉良性病變組織中AXL、YAP和NCAPH的表達情況，發現AXL、YAP和NCAPH與喉癌的發生、發展及預后有著密切的關系，提示NCAPH、AXL和YAP在評估喉癌患者遠期生存中具有重要的指導意義。而3種目標蛋白在喉癌組織中的表達強度均與EMT機制有關聯，3種目標蛋白在喉癌組織中的表達和分子作用機制可能都有一定的關聯性。本研究樣本量較少，實驗方法較為單一，且隨訪時間短，所得結論需要進一步研究證實。經過擴大樣本量、利用多種實驗方法以及延長隨訪時間進一步研究，明確其作用機制，聯合檢測AXL、YAP和NCAPH有望作為一組新的喉癌預后判斷的客觀指標，甚至有望成為喉癌臨床分子治療的有效靶點。