長鏈非編碼RNA LINC00475影響子宮內膜癌發生發展的關聯研究

陳永秀 譚曉嫦 黃曉文 麥碧 胡桂英 羅喜平

廣東省婦幼保健院婦科（廣州511400）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是由于子宮內膜上皮惡變而產生的常見婦科腫瘤，在女性生殖道惡性腫瘤中所占比例高達20%～30%［1］。數據顯示，2015年我國EC新發病率約為6.3萬例，其發病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡年輕化［2-3］。目前對EC變早期診斷和預后判斷尚未有較可靠的手段和方法。惡性腫瘤是環境-基因共同作用的結果。近年來隨著生物技術的發展和應用，從分子微觀角度揭示腫瘤的發生、發展過程促進了惡性腫瘤的臨床診治水平［4］。隨著基因組學測序技術和生物信息學的發展，發現了人體內存在大量的非編碼蛋白的轉錄產物，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是重要的組成部分。它是一類長度超過200nt的轉錄單元，在許多重要的生物進程中起著至關重要的調控作用［5-6］。因此，LncRNA的異常表達可引起機體內細胞功能的異常而導致疾病發生［7］。研究報道LncRNA與癌癥形成、發展、侵襲轉移等過程密切相關，為惡性腫瘤的臨床診治和預后評估提供了新的生物標志［8］。目前國內外關于LncRNAs與EC關系的報道不多［9-10］，且很多研究是基于生物信息學探索LncRNAs影響EC發生、發展過程的關聯；大部分LncRNAs在EC中的功能機制尚未明確［11］。此外，如何高效可靠地篩選出與EC相關的LncRNA是一個很具挑戰的難題。在本研究中，筆者前期通過高通量測序技術檢測EC組織的LncRNA表達，并結合TCGA公共數據庫的EC表達譜數據，篩選出差異性表達的LncRNAs。同時，通過生物信息學分析鑒定在EC發病中具有潛在功能的特異性分子。基于上述研究策略，筆者篩選并初步發現，LINC00475在癌組織中呈顯著的低表達狀態。因此，筆者擬進一步擴大臨床樣本檢測LINC00475在EC組織的表達情況，分析其表達與EC發病、臨床進展和預后的關系，并利用功能學實驗分析該LncRNA的生物學功能，闡明該LncRNA潛在的臨床應用意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象資料及隨訪本研究的110例EC病例選取于2012年1月至2017年12月在我院行手術治療并經病理學確診的患者。組織標本在手術切除采集后立即置于液氮中凍存。全部患者手術前均未接受過化療、分子靶向或激素治療。110例患者的年齡29～77歲，平均（55.3±10.3）歲。根據2014年國際婦產科聯盟分期（FIGO 2014）Ⅰ期和Ⅱ期患者共88例，Ⅲ期和Ⅳ期患者22例。組織病理類型為子宮內膜樣腺癌93例、非子宮內膜樣腺癌17例。根據病理分級G1級EC 35例，G2級55例，G3級20例。淋巴結轉移陽性患者16例，淋巴結轉移陰性患者94例。對本研究病例隨訪采用電話訪問方式，直接聯系患者本人或其家屬，從病例確診收集后每間隔6個月隨訪一次。隨訪截止日期為2018年6月30日。記錄患者的生存狀況。生存時間為自患者確診之日至隨訪截止日期或死亡的時間，以月為單位計算。觀察終點為患者死亡或隨訪日期截止。在隨訪期間失訪將不納入后續的生存分析。截止到最后一次隨訪時間，具有完整生存信息并納入預后分析的病例共87例。參與本實驗患者均簽署知情同意書，并已通過醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑和儀器細胞培養基1640和胎牛血清購自美國Hyclone公司，轉染試劑LipofectamineTM3000 Reagent購自美國Invitrogen公司。CCK8試劑盒購自上海碧云天公司，RNA提取試劑Trizol Reagents、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Takara）均購自大連寶生物公司。Transwell小室和基質膠購自美國BD公司，PCR引物由上海生工公司合成。酶標儀購自美國熱電公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。倒置顯微鏡來自日本Olympus。

1.3主要實驗方法

1.3.1LINC00475載體構建參考UCSC基因組數據庫LINC00475轉錄本序列，使用primer premier 5.0軟件設計擴增基因全長的引物，采用in-Fusion技術克隆入pcDNA3.1表達載體，表達載體的酶切位點設為XhoI/BamHI；T4 DNA連接酶連接，篩選，質粒擴增并測序鑒定。

1.3.2細胞轉染和篩選取對數生長期的Ishikawa細胞接種在12孔細胞板內，待細胞達到約80%匯合度，用LipofectamineTM3000轉染試劑按說明書配置轉染體系，將pcDNA3.1-LINC00475和pcDNA3.1空白質粒分別轉染至Ishikawa細胞，轉染6 h后換液培養，G418藥物篩選穩定表達細胞系。細胞表達效率利用實時定量熒光PCR法（qPCR）法檢測驗證。

1.3.3qPCR檢測基因表達用Trizol法常規提取EC組織總RNA，依照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA后保存在4℃冰箱備用。根據LINC00475基因序列，利用Primer Premier 5.0設計特異性擴增引物，具體引物信息如下：LINC00475上游引物：CTCATCCATGCCTCCACATT，下游引物：GAGATGCCCAAAAAGCCAAG；β-actin內參引物分別是GGCGGCACCACCATGTACCCT和AGGGGCCGGAC TCGTCATACT。qPCR反應體系為 25 μL：上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 10 μL，SYBR Green Mix 12 μL。擴增條件：預變性 95℃5 min，1個循環；PCR擴增95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環；溶解曲線：95℃ 5 s；60℃ 1 min。降溫：50 ℃ 30 s，1個循環。

1.3.4細胞表型實驗細胞增殖活性檢測時消化對數生長期的穩定轉染細胞，以500 cells/孔分別種植于96孔細胞板中。在培養箱孵育24、48、72和96 h后，棄去培養基，用PBS清洗1～2遍，將CCK-8試劑與培養基按體積比為1∶9配制混合液，加入100 μL新配制混合培養基，置于培養箱避光繼續培養2 h，用全自動酶標儀（檢測波長為450 nm）檢測樣品吸光度值，每組細胞設置5個復孔。遷移實驗所用小室為Corning公司孔徑為8 μm的遷移小室，侵襲實驗選用Corning公司的BD BioCoat Matrigel Invasion 8 μm小室。取200 μL細胞懸液（1×105/mL）于Transwell小室常規培養24～48 h，取出小室PBS清洗，甲醛固定，0.1%結晶紫染液染色30 min，用棉簽拭去小室內層膜上的未穿透的細胞，自來水沖洗后置室溫干燥。于100×顯微鏡下隨機選取十個視野，記錄遷移至微孔膜下層的細胞數量。檢測細胞侵襲能力除使用專用于侵襲的小室不同外，其余操作同遷移實驗。

1.4統計學方法應用R 3.2統計軟件進行本研究所有數據的處理和分析。計量資料用均數±標準差描述，基因表達在癌-癌旁組間比較采用配對t檢驗；采用卡方檢驗進行計數資料及率的比較。Logistic回歸模型分析基因的表達水平與EC患者臨床病理特征的關系；采用Spearman進行相關性分析。Kaplan-Meier法繪制生存曲線并以log-rank檢驗不同組間的生存時間差異。Cox比例風險回歸模型分析LINC00475表達對EC預后的影響，利用rms包建立列線圖預測模型，采用Bootstrap進行內部驗證，重復抽樣1 000次，計算C指數（C-index）。所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC00475在EC組織中的表達如圖1所示，LINC00475在EC組織中的表達水平明顯低于對應的癌旁正常組織，差異具有統計學意義（0.001 2±0.000 6 vs.0.001 8±0.000 9，P＜0.001）。

圖1 LINC00475在EC的表達情況Fig.1 The relative expression of LINC00475 in EC

2.2 LINC00475表達水平與EC臨床特征的關聯分析進一步探討該LncRNA表達水平與EC病例的臨床病理特征之間的關系。結果見表1，LINC00475表達與年齡、病理類型、FIGO分期、腫瘤分級之間無明顯統計學關聯（P＞0.05），但與EC淋巴結轉移顯著相關（P=0.030）；以無轉移的EC病例作為參照，高表達LINC00475的患者淋巴結轉移的風險明顯下降（OR=0.28，95%CI：0.09～ 0.94）。

2.3 LINC00475表達對EC預后的影響筆者通過將EC患者LINC00475表達量和患者的生存資料進行分析，發現LINC00475高表達患者的中位生存期（median survival time，MST）為 39.6個月，較低表達組的患者中位生存期（27.2個月）明顯延長，差異具有統計學意義（P=0.004，圖2A）。單因素Cox回歸分析結果顯示：與低表達組相比，高表達LINC00475病例的死亡風險顯著下降（HR=0.54，95%CI：0.11～0.92）；多因素校正后（校正年齡、FIGO分期、腫瘤分級、淋巴結轉移等），LINC00475高表達后降低EC患者死亡風險的效應仍具有統計學意義（HR=0.48，95%CI：0.12～ 0.98）。納入FIGO分期、淋巴結轉移和LINC00475表達等變量建立預測EC患者死亡風險的列線圖模型（圖2B），該模型生存預測的C-index為0.904；應用Bootstrap法進行重抽樣驗證，其模型的C-index為0.839。

2.4LINC00475表達對EC細胞表型的影響見圖3。CCK-8細胞增殖實驗顯示LINC00475過表達組細胞的增殖速率明顯低于空白對照組。兩組細胞在第4天時的增殖速率為：LINC00475過表達組（73.8±12.1）%，空白對照組細胞（116.5±13.4）%，差異具有統計學意義（P＜0.001）。此外，在Transwell遷移和侵襲實驗中，過表達LINC00475的內膜癌細胞穿透小室的細胞數量均顯著少于空白對照組細胞［遷移實驗：（38.6±8.3）vs.（62.3±10.9），P ＜ 0.001；侵襲實驗：（30.2 ± 12.6）vs.（48.9± 11.2），P ＜ 0.001］。

表1 LINC00475表達與EC臨床病理特征的關系Tab.1 Associations between LINC00475 expression and EC clinicopathological features 例（%）

圖2 LINC00475不同表達情況下EC患者的生存曲線及列線圖Fig.2 Survival curve and nomogram of EC patients with different LINC00475 expression

3 討論

在本研究中，筆者分析了LINC00475與EC發生、發展的關系。結果發現LINC00475在EC組織中低表達，其異常低表達能顯著增加EC患者淋巴結轉移的風險，導致患者生存時間縮短和不良預后。生物學實驗證實該LncRNA能夠影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移表型。

EC是女性生殖系統最為常見的三大惡性腫瘤類型之一，近年來發病率在世界范圍內的上升趨勢明顯，嚴重危害婦女健康［12］。EC早期診斷的患者一般預后較好，5年生存率超過90%［2］。但是臨床上仍有部分患者出現癌灶轉移，導致預后不良［1］。因此，闡明EC發病的生物機制，尋找新的診斷和特異性治療靶點對于改善EC的預后具有至關重要的作用。近年來大量研究表明，作為基因調控網絡中的重要分子，LncRNA為研究復雜疾病的病理生理過程和發病機制提供了新的途徑［13-15］。LncRNA以RNA的形式在多種層面上，如表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等調控基因的表達水平［16-17］。研究已證實，LncRNA與腫瘤的發生存在密切的關系，且參與了腫瘤的發生、轉移和侵襲等過程［18-19］。LncRNA在EC的發生發展中亦扮演著重要角色。XIE等［20］研究發現LncRNA CCAT2在EC組織中高表達。該LncRNA可通過海綿吸附miR-216b調節Bcl-2、影響PTEN/PI3K/AKT和mTOR信號通路的活化，進而影響腫瘤細胞的生長及轉移。盡管這些研究的結果表明，LncRNAs有可能在腫瘤形成、進展中起著關鍵的調控作用，對于LncRNAs在特定腫瘤中的表達調控以及它們參與腫瘤發生發展的分子機制仍需進一步闡明。

圖3 LINC00475生物學功能Fig.3 The biological functions of LINC00475

在本研究中，筆者基于前期轉錄組數據提示，探討新發現的LINC00475與EC發病和預后的關聯。本研究結果顯示該LncRNA在內膜癌癌組織的表達水平低于對應的癌旁正常組織，且其表達與淋巴結轉移有關，能顯著增加淋巴結轉移的風險。生存分析結果顯示低表達LINC00475的患者，其生存時間明顯低于高表達組的EC患者。LINC00475能影響EC發病和預后的關系在基于TCGA公共數據庫的生信分析中也得到了一致的結果，提示LINC00475是參與EC發生、發展過程的特異性分子。目前臨床上尚缺乏對EC疾病精準評估的生物標志物。最近有研究報道了LINC00475在胃癌組織中聯合其他9個LncRNA可作為胃癌發病的生物標志［21］，但未分析其預測效能。在本研究中，筆者發現該LncRNA結合FIGO分期、淋巴結轉移等因素能對EC患者的預后有良好的預測效能，提示LINC00475可作為臨床精準評估EC患者生存預后的特異生物標志物。對于LINC00475在EC腫瘤作用中的分子機制未見報道。筆者在本研究中利用系列功能學實驗檢測該LncRNA對細胞表型的效應，結果發現高表達LINC00475后能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學過程。進一步通過生物信息學分析發現，LINC00475能特異性結合ADAM22基因，并潛在改變ADAM22的表達。已有報道ADAM22基因參與腫瘤細胞的粘附、增殖等生物學過程，且是影響腫瘤化療結局的靶點［22］，故此，筆者推測低表達LINC00475通過異常調控ADAM22的表達而導致EC患者的預后不良。但是該LncRNA是在轉錄前還是轉錄后水平對ADAM22基因進行調控，具體的調控方式如何；該LncRNA如何通過調控相關基因的表達而影響EC的發生、發展，在后續研究中仍需應用系列生物學實驗進一步進行驗證。以往的大部分研究都是基于候選基因策略研究特定分子與疾病的關系。在本研究中，筆者利用高通量數據篩選在EC中特異性表達LncRNA，大大提高了研究的效率；此外，筆者的研究結果提示LINC00475對EC發病和預后具有良好的預測效果，亦為臨床工作中對EC患者的精確診治及預后評估提供了潛在的生物標志。

綜上所述，本研究報道LINC00475是一個新的在EC中具有抑癌效應的非編碼RNA，與EC發生、臨床轉移和預后密切相關，可作為EC發生發展過程評估的生物標志物。