早發性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR細胞水平與卵巢儲備功能的相關性

宗國霞 王威 夏宇躍 朱麗陽 區宇潔 林炳耀

廣東省佛山市第四人民醫院1婦科，2檢驗科，4藥劑科（廣東佛山528000）；3廣州金域醫學檢驗中心（廣州510330）

早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40歲之前由各種原因導致的卵巢功能提前衰竭，其導致患者閉經提前，血清的卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素水平降低的一種綜合征［1］。目前對于POI其發病機制并未明確。研究［2］發現，POI患者其外周血中存在多種T細胞亞群的改變。人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是由HLA基因復合體所編碼的產物，其在免疫反應中起關鍵作用［3］。HLA-DR表達于多種淋巴細胞中，其中細胞表明HLA-DR陽性的T淋巴細胞是T淋巴細胞活化的重要標志。POI患者卵巢組織顆粒細胞中HLA-DR抗原異常表達［4］，但對于POI患者中外周血中T細胞的HLA-DR表達水平仍缺乏研究。本研究旨在探討早發性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR細胞的表達水平，并分析其與自身免疫及卵巢儲備功能的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料選取于2017年3月至2018年10月于我院就診的早發性卵巢功能不全患者共63例（POI組），納入標準：（1）符合早發性卵巢功能不全的診斷標準［5］；（2）排除盆腔占位性病變；（3）排除盆腔炎癥；（4）獲得患者知情同意。排除標準：（1）因卵巢手術、化療所致的卵巢衰竭；（2）合并免疫性疾病；（3）1個月內服用過激素、免疫抑制劑及其他抗腫瘤藥物。選擇于我院體檢同期健康育齡女性（對照組）各例作為對照。健康育齡女性的納入標準：年齡＜40歲，月經正常，無盆腔占位病變或其它惡性腫瘤，無合并婦科炎癥或合并其它代謝、免疫性疾病。兩組患者的同質性良好（表1）。

表1 兩組患者的一般資料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

表1 兩組患者的一般資料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

組別POI組對照組χ2/t值P值例數63 40年齡（歲）30.6±3.4 29.4±3.5 1.726 0.087初潮年齡（歲）13.7±1.7 13.6±1.9 0.278 0.782 BMI(kg/m2)22.3±2.0 21.9±1.6 1.066 0.289孕次（次）0.9±0.4 0.8±0.5 1.121 0.265

1.2檢測指標和方法（1）記錄兩組女性的一般資料，包括年齡、初潮年齡、體質量指數（BMI），記錄POI患者的病程時間。（2）CD3+HLA-DR細胞和相關免疫細胞檢查：清晨空腹抽靜脈血5 mL，離心分離外周血的淋巴細胞備測。采用PE-conjugated anti-HLA-DR和FITC-anti-CD3的同型單克隆抗體進行孵育，采用美國BD公司流式細胞儀檢測CD3+HLA-DR抗原淋巴細胞的表達水平。采用同樣的方法檢測CD3+、CD4+、CD8+、的T細胞亞群，記錄CD4+/CD8+的比例，相關試劑由廣州金域檢驗公司提供。（3）采用羅氏電化學發光檢測性激素六項［FSH、LH、T、P、E2和PRL、抗苗勒管激素（AMH）、抑制素A（INHA）、抑制素B（INHB）］的含量，相關試劑由廣州金域檢驗公司提供。

1.3統計學方法采用SPSS 24.0分析數據。計量資料采用均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，計數資料采用百分比表示，比較采用χ2檢驗，兩指標關系采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組患者的外周血CD3+HLA-DR細胞表達對比POI組的外周血CD3+HLA-DR細胞比例顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組的外周血CD3+HLA-DR細胞表達對比Fig.1 Comparison of peripheral blood CD3+HLA-DR cells expression between the two groups

2.2兩組的免疫相關細胞的表達水平POI組外周血的CD3+和CD8+細胞表達水平顯著高于對照組，而CD4+以及CD4+/CD8+的水平顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3兩組的性激素和卵巢儲備功能指標對比POI組性激素中的FSH、LH水平顯著高于對照組，而T、P、E2和PRL顯著低于對照組（P＜0.001）。而POI組的AMH、INHA和INHB水平均顯著低于對照組（P＜0.001）。見表3。

表2 兩組免疫相關細胞的表達水平對比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

表2 兩組免疫相關細胞的表達水平對比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

組別POI組對照組t值P值例數63 40 CD3+（%）73.6±5.7 68.2±8.4 3.888＜0.001 CD4+（%）32.9±3.6 38.8±5.2 6.804＜0.001 CD8+（%）34.7±4.3 25.4±4.6 10.412＜0.001 CD4+/CD8+0.947±0.142 1.536±0.235 15.870＜0.001

表3 兩組的性激素和卵巢儲備功能指標比較Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

表3 兩組的性激素和卵巢儲備功能指標比較Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

指標FSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)P(nmol/L)E2(pmol/L)PRL(ng/L)AMH（ng/mL）INHA（pg/mL）INHB（pg/mL）POI組（n=63）45.2±6.5 39.4±13.2 1.1±0.6 4.3±2.6 71.3±25.4 142.3±39.6 0.12±0.06 24.2±3.6 7.5±4.3對照組（n=40）14.2±7.4 18.5±9.6 1.7±0.5 16.5±6.8 376.8±87.2 252.4±63.8 5.3±2.2 37.3±10.4 53.6±17.7 t值22.347 8.659 5.267 12.864 26.178 10.818 18.731 9.189 19.823 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4POI患者外周血CD3+HLA-DR水平與各項指標的關系POI中的外周血CD3+HLA-DR表達水平與CD3+、CD8+呈顯著的正相關，與CD4+和CD4+/CD8+的水平呈顯著的負相關（P＜0.001）；與性激素中的FSH、LH呈顯著的正相關（P＜0.001），與P和E2呈顯著的負相關（P＜0.001）；與卵巢存儲功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈顯著的負相關（P＜0.001）。見表4。

3 討論

POI與自然絕經不同，因卵巢功能障礙，直接導致育齡女性的不孕癥［6］。POI最大特點是異常低水平的雌激素和高水平的FSH，這表明卵巢不再通過產生雌激素和發育受精卵來響應循環FSH，卵巢進而出現萎縮。研究［7］表明，免疫學機制在POI的病情進展中具有重要的意義。由于目前仍缺乏有效的指標預測病情的進展，HLA-DR是MHC-II類分子，其主要表達于多種淋巴細胞上，對于T細胞中HLA-DR的表達表明T細胞存在激活狀態［8］，既往報道［4］顯示卵巢細胞中的HLA-DR抗原的異常表達可能參與了POI的病理過程，本研究也發現POI組患者的CD3+HLA-DR細胞比例顯著升高，與既往研究相符合，但POI患者外周血的CD3+HLA-DR細胞水平與自身免疫及卵巢存儲功能仍未明確。

表4 POI患者外周血CD3+HLA-DR表達水平與各項指標的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of CD3+HLA-DR expression levels in peripheral blood of patients with POI and various indicators

本研究初步結果顯示了POI患者外周血的CD3+HLA-DR細胞水平顯著高于正常對照組的婦女，HLA-DR是發揮抗原呈遞作用的關鍵效應分子，因此外周血T細胞亞群的變化也反應了POI患者機體內存在T細胞介導的免疫損傷［9］。POI患者中其外周血的CD4+以及CD4+/CD8+的水平顯著低于對照組，這也是反應機體出現T細胞介導的免疫損傷的重要表現。T細胞亞群中的輔助細胞和殺傷抑制細胞兩者比例失調后可導致機體免疫狀態抑制，POI患者其機體存在著細胞免疫功能紊亂的狀態。CD8+T細胞的分化和效能增加，促進了卵巢誘發自身免疫應答，從而導致顆粒細胞凋亡，也加快了卵巢閉鎖。相關性分析的結果也顯示了CD3+HLA-DR細胞水平與CD3+、CD8+呈顯著的正相關，與 CD4+和 CD4+/CD8+的水平呈顯著的負相關，這表明了細胞機體內的CD3+HLA-DR細胞水平能顯著反應機體的細胞免疫應答狀態。

POI組的卵巢儲備功能指標中AMH、INHA和INHB水平均顯著低于對照組。本結果發現了CD3+HLA-DR與卵巢存儲功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈顯著的負相關。表明CD3+HLADR參與了調節了POI患者的性激素水平變化和影響了卵巢存儲功能。POI的基礎是由T細胞調節改變引起的細胞介導的自身免疫反應。其機制可能為活化狀態的T細胞加速了對卵巢顆粒細胞的免疫應答，介導卵巢顆粒細胞的損傷。AMH是轉化生長因子中的一種亞型，在卵泡部位分泌并表達，對卵泡發育起至關重要的作用［10］，而INHA和INHB主要由卵巢顆粒細胞分泌，當活化T細胞介導卵巢顆粒細胞的損傷后，導致卵巢顆粒細胞AMH、INHA和INHB的減少。這就顯示了CD3+HLA-DR是調節卵巢儲備功能和性激素水平的重要T細胞亞群。對于T細胞活化介導卵巢顆粒細胞損傷的機制仍需要進一步需要細胞和動物實以驗證POI患者外周血CD3+HLA-DR細胞水平與卵巢儲備功能的相關性。

本研究為單中心研究，仍需納入更多病例和指標進行綜合分析。綜上所述，早發性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR細胞水平與自身免疫功能、性激素水平具有密切的關系，與卵巢存儲功能呈顯著的負相關。