長鏈非編碼RNA-TCL6在胎盤植入組織中的表達水平及對滋養層細胞活性和遷移的影響

王瑞 吳淑貞 李楊 陳娟

廣東省佛山市婦幼保健院產科（廣東佛山528000）

胚胎發育，胚胎植入和胎盤發育是哺乳動物成功懷孕的先決條件。滋養細胞是胎盤絨毛的特化細胞，在調節胚胎發育中起著至關重要的作用［1］。胎盤絨毛滋養細胞穿入部分宮壁肌層，可導致胎盤植入，該疾病是產科的嚴重并發癥。滋養細胞是上皮細胞系的胎盤細胞，特別在胎盤植入的孕婦中其滋養細胞具有高度增殖和侵襲性［2］，滋養細胞增殖和侵襲性是導致胎盤植入的重要病因之一，找到調控滋養細胞增殖和侵襲性的機制是預防和治療胎盤植入的重要方向［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是一類長度超過 200 nt的核苷酸轉錄物［4］。研究［5］表明，多種LncRNAs參與了調節滋養層細胞的功能，且研究表明多種LncRNAs可以在孕婦的胚泡和蛻膜中差異表達，并且其能夠調節滋養層細胞的增殖和侵襲［6］。既往有研究［7］表明，LncRNA-TCL6在先兆流產妊娠的胎盤組織中高表達，但LncRNA-TCL6對于胎盤植入的影響仍未明確。本研究旨在探討LncRNA-TCL6在胎盤植入組織中的表達水平及對滋養層細胞活性和遷移的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象選取本院2017年6月至2018年12月于我院行剖宮產的患者共80例，其中符合胎盤植入診斷的40例（植入組），所有患者符合《胎盤植入診治指南（2015）》的診斷標準：分娩前依靠臨床高危因素結合彩色多普勒超聲或MRI征象評估，最終確診需要根據手術中或分娩時所見或分娩后的病理學診斷。選擇正常胎盤40例（正常組），取胎盤與母體子宮相鄰的胎盤組織，用無菌PSB洗滌所有收集的組織，然后立即快速冷凍液氮，儲存在-80℃待測。本研究獲得醫院倫理委員會審核通過，所有產婦均簽署知情同意書。

1.2細胞培養和處理HTR-8/Svneo人絨毛膜滋養層細胞購自上海中科院細胞庫，標準培養條件下于37℃在5%CO2培養箱中生長，培養基采用10%胎牛血清的RPMI 1640培養基進行培養，采用100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素（Gibco，Grand Island，NY，USA）預防細菌污染。

1.3RNA提取和RT-PCR用Trizol試劑（Invitrogen）從中胎盤組織或細胞中分離總RNA。采用逆轉錄試劑盒（TaKaRa Bio，Japan）對所提取的總RNA進行反轉錄成cDNA，將1 mg的總RNA反轉錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa Bio）用于測定胎盤或細胞中SPRY4-IT1表達水平，具體的引物為 LncRNA-TCL6：F：TGTCTCATTCGCCTCTGGAT，R：GTCTCCCTCCTTCTGCCTTT；采用GAPDH作為內參對照，GAPDH：F：CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，R：ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC。用ABI 7500進行qRT-PCR測定（Invitrogen）。分析結果并相對于閾值循環（CT）值表達，通過2-ΔΔCt法計算 LncRNA-TCL6 在胎盤組織中或細胞中的表達水平。

1.4細胞轉染將HTR-8/Svneo細胞在6孔板鋪板后，采用Lipofectamine2000（Invitrogen）嚴格按照說明進行轉染，用陰性對照（NC）：UUUGUAUUCUGAAUCGGAUGA，si-LncRNA-TCL6-1：UGGAUUUGUACCAUUCUUCUG，si-LncRNA-TCL6-2：ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG，和 si-LncRNA-TCL6-3：UCAUAUUCUGAAUCUCAUCCU，轉染HTR-8/Svneo細胞。轉染后6 h，更換培養基并收集細胞用于后續實驗。

1.5細胞活性檢測取對數生長期的HTR-8/Svneo細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，每組設5個復孔，檢測敲低LncRNA-TCL6表達與否對HTR-8/Svneo細胞的活性情況，細胞經培養8、24、48、72、96 h后加入CCK-8溶液20 μL，繼續培養4 h后恒溫低速振蕩10 min，然后用多功能酶標儀（測量波長450 nm）檢測各處理組吸光度（OD）值。

1.6細胞劃痕實驗和遷移實驗劃痕實驗：將細胞接種在六孔板中，轉染并生長至80%～90%匯合。通過用移液管尖端刮擦板來產生傷口，并用PBS除去碎片。獲得圖像以評估細胞在指定時間點遷移到傷口區域的能力，每個實驗均至少重復3次。Transwell遷移實驗：6×104經轉染的HTR-8/SVneo細胞將懸浮于含有1%FBS的RPMI 1640中，并加入 Transwell小室上室（孔徑為8 μm；EMD，Millipore，Billerica，MA，USA）。 在下室中，加入700 μL含10%FBS的RPMI 1640培養基，在37℃和5%CO2下孵育24 h后，細胞侵入Transwell小室下層，用結晶紫染色，計數，并通過Olympus IX71倒置顯微鏡成像，每個小室取5個視野進行統計，取其平均值，本實驗重復3次。

1.7Western-Blot檢測采用RIPA細胞裂解液（Beyotime，中國上海）提取HTR-8/Svneo細胞的總蛋白質，采用10%SDS-PAGE進行電泳分離，并采用濕轉法轉膜到PVDF膜上（Millipore），經5%脫脂牛奶1封閉小時后，采用相應的一抗孵育4℃過夜。E-Cadherin 兔單抗（1∶1 000，No.3195），N-Cadherin兔單抗（1∶1 000，No.13116），Vimentin（1∶1 000，No.5741），GAPDH（1∶2 000，No.5174），抗體均夠自Cell Signaling Technology（CST）公司。用TBST洗膜三次后，將膜培養用相應的二抗（Beyotime，中國上海）在室溫下孵育1 h后，采用ECL發光法進行顯影。

1.8統計學方法采用Graphpad prism 7.0軟件包進行數據分析。數據均數±標準差表示，兩組組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK法檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1胎盤植入患者胎盤組織的LncRNA-TCL6表達水平植入組的胎盤的LncRNA-TCL6的相對表達量為（3.42±0.41）倍數變化，顯著高于正常組（P ＜0.05），見圖1。

2.2敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細胞活性的影響采用不同的siRNA轉染敲減HTR-8/Svneo細胞LncRNA-TCL6表達水平后，不同組HTR-8/SVneo的LncRNA-TCL6表達水平見圖2A，3組經轉染SiRNA的LncRNA-TCL6表達水平均顯著低于NC組（P＜0.05），si-LncRNA-TCL6-2的敲減效率最高。對HTR-8/Svneo細胞敲減LncRNA-TCL6表達水平后，其8、24、48、72、96 h的細胞活性顯著低于NC組（P ＜0.05），見圖2B。

圖1 正常組和植入組的LncRNA-TCL6表達水平對比Fig.1 Comparison of LncRNA-TCL6 expression levels between normal and implanted groups

2.3 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細胞遷移能力的影響對HTR-8/SVneo細胞的LncRNATCL6敲減后，劃痕實驗結果顯示敲減組24、48 h的細胞遷移率均顯著低于NC組（P＜0.05）；且Transwell遷移實驗結果顯示敲減組其24 h的細胞遷移數顯著低于NC組（P＜0.05），見圖3。

圖2 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細胞活性的影響Fig.2 Knockdown of the effect of LncRNA-TCL6 on HTR-8/SVneo cell activity

圖3 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細胞遷移能力的影響Fig.3 The effect of LncRNA-TCL6 on the migration of HTR-8/SVneo cells

2.4 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細胞相關蛋白的表達si-LncRNA-TCL6的HTR-8/Svneo細胞其E-Cadherin表水平顯著上升，而Vimentin、N-Cadherin的表達水平顯著下降，見圖4。

圖4 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo蛋白表達的影響Fig.4 The effect of knockdown of LncRNA-TCL6 on HTR-8/Svneo protein expression

3 討論

研究［9］表明，只有不到2%的人類基因組可以轉錄為蛋白質編碼基因。其他轉錄本，包括眾所周知的microRNA，還包括LncRNAs均不轉錄成蛋白質發揮作用。研究［10］顯示LncRNA已經成為基因表達的關鍵調節因子，并參與了多種疾病的發生和進展。有研究報道了先兆子癇中LncRNA的表達譜與胎盤病理學之間存在關聯［11］。在既往研究［12］中報道了PE中的LncRNA-TCL6在先兆流產中的胎盤組織中存在異常表達，但其具體與胎盤植入的關系仍缺乏相關研究。在本研究中，筆者進一步驗證了胎盤植入患者胎盤組織中LncRNATCL6的表達水平顯著升高，且敲低LncRNA-TCL6的表達抑制HTR-8/Svneo細胞的細胞遷移能力，也初步表明了LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細胞遷移能力的調控是通過上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相關蛋白參與的，為LncRNA-TCL6在胎盤植入的調控機制中提供了理論基礎。

本研究首先探討了LncRNA-TCL6在胎盤植入患者中胎盤組織的表達情況，表明了LncRNATCL6在胎盤組織中存在高表達。同時既往有研究［13］探討了循環胎盤相關的LncRNA作為先兆流產的潛在生物標志物，鑒定了胎盤中存在多種LncRNA差異表達。關于LncRNA調控滋養層細胞增殖的研究中，既往研究表明了內源性的LncRNAATB的抑制可降低了HTR-8/Svneo細胞的增殖和管形成［14］。而也有研究表明LncRNA-TUG1能在PE患者的胎盤樣本中顯著減少，敲低TUG1能影響滋養層細胞體外細胞增殖，凋亡，遷移和網絡形成［15］。因此，本研究明確了胎盤組織中的LncRNATCL6是促進滋養層細胞增殖和促進胎盤植入的重要LncRNA，但對于LncRNA-TCL6是否在循環中能檢測到仍需要進一步評估。

EMT過程通常與許多人類疾病的發生和發展有關，由于胎盤滋養層細胞發生EMT程序在胎盤植入中具有重要意義。既往研究［16］提出胎盤滋養層細胞從附著的表型轉變為遷移表型，這種遷移表型在類似于其他發育EMT的過程中侵入母體蛻膜和螺旋動脈，這可能是導致胎盤植入發生的重要機制，但目前對于胎盤滋養層細胞通過EMT侵入母體蛻膜和動脈的機制仍未明確。本研究結果明確了LncRNA-TCL6參與了滋養細胞的細胞遷移和侵襲。在HTR-8/Svneo滋養層細胞敲減LncRNA-TCL6的表達水平后，細胞的活性顯著下降，而細胞的遷移能力也顯著下降。而細胞發生EMT遷移中，其EMT相關的細胞結構蛋白會先發生變化，因此本研究中也進一步分析了敲低LncRNA-TCL6表達后，檢測HTR-8/Svneo細胞發生EMT的相關蛋白如E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin的表達水平的變化，結果也顯示了干預后其E-Cadherin表水平顯著上升，而Vimentin、N-Cadherin的表達水平顯著下降，因此，LncRNATCL6通過了調控EMT的相關蛋白的表達水平參從而抑制了滋養層細胞的遷移能力。既往有研究［17］顯示LncRNA-TCL6可通過調節EGFR途徑抑制細胞的增殖，鑒于EGFR通路在滋養細胞增殖和分化以及胚胎著床中的重要作用，同時EGFR途徑也能影響細胞發生EMT，因此懷疑LncRNA-TCL6可能通過調控了EGFR途徑影響胚胎植入。但進一步具體的LncRNA-TCL6調控滋養層細胞的分子機制仍需要進一步驗證和深入研究。

綜合上述，本研究結果初步表明LncRNATCL6在胎盤植入組織中表達顯著升高，且LncRNA-TCL6參與滋養層細胞的增殖和遷移作用，因此LncRNA-TCL6有望成為治療胎盤植入的重要靶點。