小鼠心肌急性缺血再灌注早期差異表達microRNA的篩選及驗證*

陳圓圓，葉 星，顏峰平

(贛南醫學院法醫學系，江西 贛州 341000)

急性心肌缺血是造成心臟性猝死的主要原因, 而一定時間缺血后再灌注不但可以加重心肌損傷, 還可造成致命性心律失常，甚至引起心臟性猝死。司法鑒定實際工作中，有很多情況是由冠狀動脈痙攣突然緩解和血栓溶解后再灌注所造成。此種情況下，由于缺血時間過短, 常規HE等染色技術看不出心肌的明顯變化, 難以作出心臟性猝死的診斷, 給司法鑒定工作帶來很大困難。因此尋找早期心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, I/R損傷)的敏感性生物標志物具有重要的法醫學應用價值。

miRNA是一種內源性長度大約為21～25個堿基的非編碼RNA，通過降解目的基因或抑制目的基因翻譯來進行轉錄后調控[1]。miRNA在急性心肌梗死、心力衰竭[2-3]、心律失常[4]等不同的心臟疾病中均出現異常的表達，被認為可能成為心血管疾病診斷、治療及預后的生物學標記物。本研究通過構建小鼠心肌缺血后再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷模型，用miRNA芯片技術篩選心肌缺血后呈差異表達的miRNAs，為研究早期心肌缺血的發病機制提供重要的理論基礎，并為心源性猝死的法醫學鑒定提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性C57 BL/J小鼠20只，體重25～30 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器5%水合氯醛(Sigma)，TRIzol試劑(Invitrogen)，Mir-X miRNA First-Strand試劑盒(Clontech)，SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，小動物呼吸機(SAR-830，CWE)，多通道生理記錄儀(上海嘉龍教儀廠)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組和模型建立小鼠隨機分為2組，每組10只，分別為I/R組和對照組。將小鼠用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，待其麻醉后左側胸部脫毛，手術區域備皮消毒，經口腔氣管插管后，連接小動物呼吸機維持呼吸，小鼠仰臥，四肢固定于手術臺上。

I/R組小鼠于胸骨左側第3、4肋間剪開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，打開胸腔充分暴露心臟，剪開心包，用帶線6-0線縫合針于心耳下緣1 mm處穿過心肌表層，結扎冠狀動脈前降支(LAD)。結扎LAD后可看到左心室前壁心肌變白，心電圖ST段抬高，判定為缺血成功[5]。確認心肌缺血后逐層關閉胸腔、縫合皮膚和肌肉，缺血45 min后，在體外將結扎線拉出[6]，心電圖顯示ST段抬高部分回落，表示再灌注成功，持續3 h后將小鼠麻醉處死取心臟。

對照組操作同缺血組，但不結扎LAD。每個樣本取部分心臟組織迅速放入RNA 保護液，以進行RNA抽提；余放入-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2總RNA提取和芯片檢測I/R組及對照組心肌組織按TRIzol一步法提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳判斷提取的RNA質量，同時用紫外分光光度法檢測所提取RNA的濃度和純度。RNA在波長為260 nm和280 nm處的吸光度比值要求在1.8～2.2范圍內，方可進行后續實驗。

首先對質檢合格的總RNA使用mirVanaTMmiRNA Isolation試劑盒(AM1561)進行純化，采用Agilent Mouse miRNA(8×60K)芯片及Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件進行分析并提取數據，然后使用Agilent GeneSpring軟件對數據進行歸一化，并采用GeneSpring軟件進行組間的差異分析；差異表達的microRNA篩選標準為：P≤0.05,同時差異倍數(fold-change, FC)在2倍以上。

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測樣本總RNA通過Mir-X miRNA First-Strand試劑盒合成cDNA，以U6為內參，利用SYBR Green實時定量PCR法檢測相應miRNA的相對表達水平，其計算方法采用2-△△Ct。U6和通用反向引物由Mir-X miRNA First-Strand試劑盒提供，挑選的差異表達miRNAqPCR引物序列見表1。

表1 miRNA熒光定量PCR引物序列

2 結 果

2.1急性心肌I/R損傷模型的構建在小鼠I/R模型構建過程中發現心肌缺血區域顏色(圖1B)較對照組心肌(圖1A)明顯呈蒼白改變；心電圖顯示心肌缺血期表現為ST段抬高，再灌注期抬高的ST段部分回落(圖1C)。以上心肌缺血后顏色改變和心電圖變化的結果表明小鼠心臟I/R損傷模型構建成功。

注：A：對照組心肌組織外觀；B：缺血心肌組織外觀，其中黑色箭頭表示心肌缺血區域；C：小鼠I/R手術前、缺血、再灌注期心電圖變化。

2.2小鼠I/R組和對照組心肌miRNAs芯片檢測結果I/R組和正常對照組心肌的miRNAs芯片檢測顯示，共篩選出52個差異表達的miRNAs，其中41個表達上調，11個表達下調，結果見表2。

表2 心肌I/R損傷相關差異表達的miRNAs

注：Fold change均為I/R組/對照組的數值，n=2。

2.3miRNA熒光定量PCR驗證結果為驗證小鼠心臟I/R損傷后miRNAs芯片檢測結果，我們選取了文獻報道與心肌I/R損傷相關的miRNA-223-3p、miRNA-154-5p和目前鮮有報道的miRNA-3113-5p、miRNA-7088-5p進行熒光定量PCR驗證。結果顯示：與對照組相比，I/R組心肌的miRNA-223-3p、 miRNA-3113-5p及 miRNA-7088-5p表達上調，miRNA-154-5p表達下調(圖2、表3)。以上 4個miRNAs的變化趨勢與芯片檢測結果基本一致，表明miRNAs芯片的檢測結果具有可信性。

注：U6為內參，n=3，與對照組比較* P≤0.05，** P≤0.01。

表3 熒光定量PCR驗證對照組和I/R組心肌組織中miRNAs相對表達量(U6為內參)

3 討 論

miRNA參與了包括心肌病、心臟肥大、心功能衰竭、心律失常和I/R損傷等多種心臟病理改變，其中許多被鑒定為在心肌缺血期間釋放到循環系統中。研究發現冠心病患者升高的血漿miRNA 223含量與其疾病的嚴重程度相關，血清miRNA 223可能成為心力衰竭患者結節病的新一代生物標志物[5-6]。循環miRNA 1, 499-5p和miRNA 133a或心肌細胞特異性miRNA 208b在ST段升高的心肌梗死(STEMI)發病的患者中立即增加，并且在疾病發作后12 h內達到峰值[7]。在心臟I/R的嚙齒動物模型中也發現了類似的觀察結果，傷后120 min上述miRNA達峰值時間[8]。以上研究提示，miRNAs可在疾病發生的極短時間內(幾小時內)被釋放入血而被檢測到。

本次我們通過構建小鼠早期心肌I/R損傷模型，采用心肌組織為研究對象。因為在法醫學實踐中，由于尸體腐敗等諸多因素影響，常難以獲得檢驗所需血樣。選取I/R損傷3 h的心肌作為實驗對象，因為缺血及再灌注時間較短、心肌組織無特異性的病理學改變，能較好模擬法醫實踐中急性心肌缺血所致猝死的情形。通過對I/R組和對照組心肌進行miRNA芯片檢測及生物信息學分析，發現共有52個差異表達的miRNAs，其中41個顯著上調，11個顯著下調。在差異表達的miRNAs中進一步選取了文獻報道與心肌I/R損傷相關的miRNA-223-3p、miRNA-154-5p及目前鮮有報道的miRNA-3113-5p、miRNA-7088-5p進行熒光定量PCR驗證。結果顯示與對照組相比，miRNA-223-3p，miRNA-3113-5p及miRNA-7088-5p表達顯著增高，miRNA-154-5p表達顯著下降，它們的變化趨勢與芯片檢測結果基本一致，證實了芯片檢測結果的可靠性。實驗結果提示可能還有大量的miRNA參與了心肌I/R損傷過程。

miRNAs在IR損傷中的具體功能及機制有待進一步研究。研究人員發現miRNA-223-3p通過靶向作用并抑制NLRP3和IKB-α的表達從而減弱心肌程序性壞死和炎癥反應的發生，提示miRNA-223-3p的高表達在I/R損傷中具有心肌保護作用[9]。體內外實驗表明在大鼠的缺血心肌中miRNA-223的表達增加，且其通過靶向作用于PARP-1從而抑制心肌的凋亡和自噬水平[10]。Dong等研究發現miRNA-154可以通過抑制GSK-3β的表達促進心肌纖維化的發生，其過程與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關[11]。目前未見有關miRNA-3113-5p、miRNA-7088-5p與心肌I/R損傷的報道，我們推測miRNA-3113-5p、miRNA-7088-5p在心肌I/R損傷中扮演了重要的角色，因此對它們的研究也是之后工作的重點。后續研究將進一步明確miRNA-3113-5p、miRNA-7088-5p在人體I/R損傷心肌中表達的特異性，并闡明具體作用和機制，為法醫學心源性猝死的死因診斷提供應用基礎。