五倍子鞣質(zhì)在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

王慶容　徐曉舒　王林先

摘要：研究中草藥復(fù)合飼料中五倍子鞣質(zhì)在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征和殘留規(guī)律，以期進(jìn)行更加有效的疾病防治和得出明確的禁藥期。采用含有五倍子的中草藥復(fù)合飼料1和復(fù)合飼料2飼喂豬，分別于0、4、8、12、24、48、96 h后取血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織，用高效液相色譜檢測各組織中沒食子酸的含量。在豬的血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織中，4、8、12、24、48 h后均檢測到了沒食子酸，但在96 h后幾乎檢測不到?jīng)]食子酸，結(jié)果表明，沒食子酸在96 h后已基本代謝完畢。

關(guān)鍵詞：沒食子酸;高效液相色譜;藥代動(dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)： R285? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0138-05

五倍子是我國傳統(tǒng)的中藥，其有效成分能凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)及多種酶，具有抗菌、抗病毒、清除自由基和抗氧化等作用。五倍子作為傳統(tǒng)中藥，有解毒、止血、斂瘡、澀腸、斂肺、止汗之功效;按其藥理還有抑突變、癌化學(xué)預(yù)防等作用[1]。五倍子在我國四川、貴州、陜西、云南、湖南、湖北6省產(chǎn)量較高，占全國總產(chǎn)量的90%以上，另外，河南、甘肅、廣東、浙江、安徽、福建、江西、山西等地亦產(chǎn)[2]。

鞣質(zhì)為五倍子的主要成分，含量可達(dá)60%～70%，它是葡萄糖上的羥基與沒食子酸所形成的酯類化合物的混合物[3]。鞣質(zhì)是一類混合物，在酸性條件下，鞣質(zhì)可水解成沒食子酸，兩者成正比關(guān)系，通過測定其中的沒食子酸含量，可反映鞣質(zhì)的多少[4]。沒食子酸是白色或微黃色針狀晶體，常溫時(shí)（25 ℃）微溶于水，易溶于沸水、乙醚、丙酮等，不溶于三氯甲烷、苯等有機(jī)溶劑[5]。沒食子酸具有強(qiáng)還原性，遇空氣中的氧變成褐色，還可與蛋白質(zhì)、凝膠、重金屬、生物堿等結(jié)合。它是植物體中一類次生代謝產(chǎn)物，以游離酸或形成酯類化合物的形式存在于五倍子、茶、沒食子等植物中，屬于低毒物質(zhì)。經(jīng)由沒食子酸生成的沒食子酸丙酯、次沒食子酸鉍等多種衍生物，可用于食品、制藥及輕工行業(yè)[6]。

在檢測藥物含量的眾多方法中，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）是有效的方法之一，它具有簡便、快速、靈敏度高、專一性強(qiáng)和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用非常廣泛。因此，利用高效液相色譜法對豬各組織中不同時(shí)段沒食子酸含量進(jìn)行檢測，觀察其代謝動(dòng)態(tài)變化過程，可以為養(yǎng)殖業(yè)以及中草藥復(fù)合飼料的生產(chǎn)、安全使用和推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將黃連、五倍子、姜、石菖蒲、紫蘇、連翹、黃芩等中草藥按一定比例混合，按1%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到普通飼料中混合成中草藥復(fù)合飼料1（用F1表示），按2%的比例添加到普通飼料中混合成中草藥復(fù)合飼料2（用F2表示），于2016年春季在遵義市沙灣鎮(zhèn)尚窩溝養(yǎng)殖場選擇30頭質(zhì)量約為50 kg的（長白）豬，隨機(jī)分為2組，先用普通飼料飼喂15 d。禁食 12 h，不禁水。之后分別飼喂中草藥復(fù)合飼料1和中草藥復(fù)合飼料2各1次，在此期間禁食不禁水。24 h后全部轉(zhuǎn)為飼喂普通飼料。從飼喂復(fù)合飼料開始，分別于0、4、8、12、24、48、96 h后每組隨機(jī)選擇1頭豬屠殺，取血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織，放入液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80 ℃的冰箱中備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：島津高效液相色譜儀（LC-20A）、恒溫柱箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、超聲波清洗機(jī)（SB-120D，寧波新芝生物科技股份有限公司）、AR2224CN電子分析天平、循環(huán)水真空泵（SH2-ⅢD，上海亞榮生化儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS-1，上海亞榮生化儀器廠）、容量瓶、微量移液器、研缽、0.22 μm 濾膜。主要試劑：甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、乙醚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（南通飛宇生物制備，供含量測定用）、純水和超純水（密理博超純水器）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 根據(jù)盛達(dá)成等的色譜條件進(jìn)行改良[7]，將有機(jī)相換為甲醇，流動(dòng)相設(shè)為甲醇、水（體積比為80 ∶ 20）。色譜柱為InertSustain C18/phenvlhexvl柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長為254 nm，泵A流速為0.20 mL/min，泵B流速為 0.80 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3.2 樣品的制備 分別稱取各個(gè)組織2 mg，加入20 mL甲醇和1 mL乙醚充分研磨后，浸泡2 h，超聲抽提30 min[8]，最后將研磨液于12 000 r/min離心15 min，離心后吸取上清液，即得樣品，將提取好的樣品放入4 ℃冰箱保存，待測。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 標(biāo)準(zhǔn)品的制備參照杜瑞蓮等的方法[4]，稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品4.15 mg于20 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解稀釋并定容，搖勻，配制成濃度為215 μg/mL的沒食子酸母液，放置在4 ℃冰箱中待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

吸取濃度為215 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6、1.2、2.4、5.0、7.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋定容，得到濃度分別為12.9、25.8、51.6、107.5、150.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用HPLC法進(jìn)行檢測分析。以峰面積（y）對濃度（x）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，得到回歸方程為y=315 527x-2 923 157，r2=0.999，RSD（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，relative standard deviation）=082%（n=5），沒食子酸在12.0～200.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳見圖1。

2.2 樣品檢測的色譜圖

將制備好的各個(gè)樣品溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中，按上述“1.3.1”節(jié)的色譜條件用HPLC法進(jìn)行檢測分析，得出各組織中沒食子酸的峰分離情況良好，各個(gè)組織中五倍子鞣質(zhì)保留時(shí)間均為10～12 min，與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品曲線的保留時(shí)間大致相同，符合定性分析的要求，所以用高效液相色譜法能夠準(zhǔn)確地測出豬體內(nèi)五倍子鞣質(zhì)的含量。用上述試驗(yàn)過程對各組織進(jìn)行處理，重復(fù)測定3次，流動(dòng)相色譜峰的峰形及結(jié)果的重現(xiàn)性均很好，RSD值均不超過5%，符合沒食子酸代謝的特點(diǎn)，在不同組織中的代謝色譜結(jié)果見圖2。將3次測定的各圖峰面積平均值代入回歸方程中，得到?jīng)]食子酸的含量見表1、表2。

2.2.1 沒食子酸在不同組織中的代謝狀況 0 h時(shí)，各個(gè)組織中都沒有檢測到?jīng)]食子酸，說明普通飼料中沒有沒食子酸或含有能分解沒食子酸的物質(zhì)。在血液中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時(shí)達(dá)到吸收高峰，48 h后血液中沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在肝臟中，4～8 h 后沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在胃中，4～8 h后沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在腎臟中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在小腸中，4～12 h時(shí)腸壁中沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在腦中，4～12 h 時(shí)沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時(shí)達(dá)到吸收高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到（圖3-A）。在96 h后，各組織中幾乎檢測不到?jīng)]食子酸，說明此時(shí)沒食子酸在豬體內(nèi)基本代謝完畢。比較圖3-A和3-B，沒食子酸的代謝曲線基本一致，說明豬對沒食子酸的吸收是比較恒定的，與飼料中沒食子酸含量不成正比關(guān)系，飼料中過多的沒食子酸可能隨糞便或尿液排出體外，但本研究沒有對糞便或尿液進(jìn)行沒食子酸含量的檢測。

2.2.2 沒食子酸在不同時(shí)段的代謝狀況 沒食子酸在豬體內(nèi)不同時(shí)段的代謝狀況如下：在4～12 h時(shí)，在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低;在24 h時(shí)，F(xiàn)1在肝臟中的含量最高，F(xiàn)2在腎臟中的含量最高，血液中的含量最低;在48 h時(shí)，在腎臟中的含量最高，血液中的含量最低（圖4-A和4-B）。

3 討論

3.1 沒食子酸在不同組織中的代謝狀況

在血液、腎臟、腸壁、腦中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時(shí)達(dá)到吸收的高峰，48 h后血液中沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在肝臟和胃中，4～8 h沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到，詳見圖3-A和3-B。在96 h時(shí)，幾乎檢測不到?jīng)]食子酸，說明此時(shí)沒食子酸在豬體內(nèi)基本代謝完畢。

3.2 沒食子酸在不同時(shí)段中的代謝狀況

在4、8、12 h時(shí)，沒食子酸在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低。在24 h時(shí)，F(xiàn)1在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低;F2在腎臟中的含量最高，在血液中的含量最低。在48 h時(shí)，沒食子酸在腎臟中的含量最高，在血液中的含量最低，此時(shí)沒食子酸在腎臟中的含量最高是因?yàn)闆]有代謝完的沒食子酸要通過腎臟排出體外，詳見圖4-A和4-B。

綜上所述，豬在飼喂F1和F2飼料后，沒食子酸在血液中的含量最少，可能是因?yàn)闆]食子酸微溶于水，難于被吸收進(jìn)入血液中。金石等分析大鼠血漿中兒茶素主要代謝產(chǎn)物沒食子酸含量，認(rèn)為茶多酚中兒茶素在血漿中僅有少量的代謝產(chǎn)物沒食子酸，可能由于兒茶素極性極強(qiáng)，水溶性高，難于被吸收進(jìn)入血液，因此代謝產(chǎn)物也比較少[9]，本研究結(jié)果與之相似。

4 結(jié)論

中草藥具有天然、高效、毒副作用少、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，含有與動(dòng)物免疫功能密切相關(guān)的生物堿、多糖、皂苷、蒽醌類、揮發(fā)油和有機(jī)酸等[10]。五倍子是具有很高的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的林產(chǎn)品，它是產(chǎn)生單寧酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、藥用鞣質(zhì)等一系列化工產(chǎn)品的主要原料。這些化工原料用在醫(yī)藥工業(yè)中， 能夠生產(chǎn)多種藥物。鞣質(zhì)具有與抗菌素相等的抑制細(xì)菌的作用，同蛋白質(zhì)絡(luò)合能制成鞣酸蛋白，治療腸道急性病癥[11]。在飼喂中草藥復(fù)合飼料4、8、12、24、48 h時(shí)，都檢測到了五倍子鞣質(zhì);在96 h時(shí)，幾乎檢測不到?jīng)]食子酸，說明此時(shí)沒食子酸在豬的體內(nèi)已經(jīng)代謝完畢，試驗(yàn)結(jié)果表明，禁藥期是96 h。

通過飼喂中草藥復(fù)合飼料后，在豬的各個(gè)器官中都檢測到了沒食子酸，其中肝臟中含量最高。肝臟除了分泌膽汁、儲(chǔ)存動(dòng)物淀粉、調(diào)節(jié)蛋白、脂肪和碳水化合物的新陳代謝以外，還有解毒、造血和凝血的作用，肝臟還是最大的解毒器官，而五倍子也有解毒、止血的功效，這就增大了肝臟解毒功效，使豬的抵抗力提高，從而有效防止疾病的發(fā)生。而在我國五倍子分布較廣，原料豐富，容易獲得，這無疑為養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的便利。

影響五倍子鞣質(zhì)被豬體內(nèi)組織吸收的因素還有很多，如能吃多少飼料、豬的體質(zhì)及其代謝速率情況、水的pH值、操作過程和藥品、試驗(yàn)儀器誤差等皆是影響本試驗(yàn)結(jié)果的因素，給本試驗(yàn)帶來極大的困難，進(jìn)一步的成分系統(tǒng)分析鑒定和比較有待深入進(jìn)行。

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