艾司洛爾對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應激蛋白的調控研究

(陜西省人民醫院急診內科,陜西 西安 710068)

膿毒癥為感染引起的全身炎癥反應綜合征，通常進展速度快、患者預后差[1-2]。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥患者早期容易發生的癥狀，也是膿毒癥在臨床上引起死亡的主要原因[3]。因此，探索急性肺損傷的相關分子參與機制及治療對改善臨床預后具有重要價值。炎癥反應因子的異常，尤其是白細胞介素家族水平的異常與肺損傷的病理過程密切相關，也是藥物治療效果的參考[4]；氧化應激是氧化還原的失衡狀態，主要是由NOX蛋白家族參與的，其水平異常也參與了多種病理過程的肺損傷[5]。艾司洛爾為β受體阻滯劑，在肺損傷的治療過程中有積極的作用[6]，但目前尚未見到其對膿毒癥急性肺損傷模型作用的報道。本文分析艾司洛爾對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應激蛋白的調控作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雄性SD大鼠40只購自上海實驗動物中心。將大鼠適應性飼養一周后隨機分為4組：對照組、模型組、地塞米松組和艾司洛爾組，每組10只。對照組和模型組大鼠給予生理鹽水(1 mL/kg)灌胃治療，地塞米松組(地塞米松0.25 mg/kg)和艾司洛爾組(艾司洛爾5 mg/kg)大鼠給予相對應的藥物灌胃，每日一次，連續6天。末次給藥后對照組給予生理鹽水尾靜脈注射，其余各組給予內毒素(3 mg/kg)尾靜脈注射造模。

1.2 試劑及儀器

艾司洛爾購自Sigma Aldrich公司；白細胞介素2(interleukin2，IL-2)和IL-6酶聯免疫吸附測定試劑盒購自R&D公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2，NOX2)一抗購自Cell Signaling公司；NOX4一抗購自Santa Cruz公司；地塞米松購自Sigma Aldrich公司；其余試劑為市售分析純。垂直電泳儀、轉膜儀及凝膠成像儀均購自Bio Rad公司；酶標儀購自累杜公司；移液器及冷凍離心機購自Eppendorf公司。

1.3 肺功能指標分析

各組動物造模24 h后進行麻醉，開腹，用經肝素抗凝處理過的血氣分析專用注射器腹主動脈采血1 mL用血氣分析儀進行動脈血氣分析，測定其氧分壓。取各組大鼠血漿及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)少許稱重，溴甲酚氯法測定血漿及BALF蛋白含量，計算LPI(LPI=BALF蛋白含量/血漿蛋白含量)。

1.4 Blotting法檢測相關蛋白

配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，以等量總蛋白進行上樣，以90 V電壓在濃縮膠中電泳。電泳30 min后把電壓升高至120 V，當溴酚藍染料達到底部邊緣以后，停止電泳，取出蛋白凝膠。把凝膠上的蛋白在90V電壓條件下電轉到硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，放在100 g/L的脫脂奶粉中，室溫條件孵育2 h。將一抗用磷酸鹽緩沖液以1∶800稀釋以后，與NC膜反應，反應條件為：4 ℃過夜。再將辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標記的二抗用磷酸鹽緩沖液以1∶3 000稀釋，于室溫中孵育2 h。用電化學發光試劑盒顯色，以Image Quant Las 4000 min拍照分析灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.5 統計分析

應用SPSS21.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間存在差異再進行SNK-q檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 艾司洛爾對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的影響分析

與對照組相比，模型組大鼠的肺功能指標呼吸頻率、肺泡通透指數均明顯升高(P<0.05)，PaO2明顯降低(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復更明顯(P<0.05)，見表1。

表1 艾司洛爾對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的影響分析

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與地塞米松組比較，cP<0.05(n=10)

2.2 艾司洛爾干預后肺泡炎癥因子水平變化分析

與對照組相比，模型組大鼠的炎癥因子IL-2及IL-6水平均明顯升高(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復更明顯(P<0.05)，見表2。

2.3 艾司洛爾干預后肺泡氧化應激蛋白水平變化分析

與對照組相比，模型組大鼠的氧化應激蛋白NOX2及NOX4水平均明顯升高(P<0.05)，而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復(P<0.05)，且艾司洛爾組恢復更明顯(P<0.05)，見圖1。

表2 艾司洛爾干預后肺泡炎癥因子水平變化分析

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與地塞米松組比較，cP<0.05

圖1 艾司洛爾干預后肺泡氧化應激蛋白水平變化分析與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05

3 討 論

膿毒癥是臨床上的常見疾病，通常會引起急性肺損傷，給患者生存狀態帶來明顯的不利影響。但目前關于膿毒癥引起急性肺損傷的相關分子機制尚不明確，可能與血管內皮細胞的損傷有關。目前臨床上對膿毒癥急性肺損傷的治療通常采用早期抗生素、中期糖皮質激素聯合血管活性藥物，但效果通常不佳。本研究在分析艾司洛爾對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡炎癥因子及氧化應激蛋白的調控作用時發現與對照組相比，模型組大鼠的肺功能指標呼吸頻率、肺泡通透指數均明顯升高，PaO2明顯降低，模型組大鼠的炎癥因子IL-2和IL-6、NOX2及NOX4水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復，且艾司洛爾組恢復更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調控大鼠肺泡炎癥因子及氧化應激蛋白的水平有關。

以往的研究發現白細胞介素水平與急性肺損傷及藥物的治療效果有關[7-8]。在分析香菇多糖對膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護作用時發現香菇多糖通過抑制IL-6、IL-1β信號分子而發揮抗炎作用，對膿毒癥誘導急性肺損傷有保護作用[9]。在分析骨髓間充質干細胞對急性肺損傷幼鼠炎癥因子IL-1β、IL-10的影響時也證實用骨髓間充質干細胞干預后，急性肺損傷幼年鼠的肺組織損傷減輕，并且IL-1β、IL-10蛋白表達較模型組顯著降低，提示骨髓間充質干細胞能夠減輕急性肺損傷肺組織的炎癥反應并參與了肺組織損傷的修復[10]。在分析人參皂苷預處理對急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α和IL-6及IL-10水平的影響時也發現人參皂苷可能通過上調IL-10的表達及下調IL-6的表達來保護大鼠的急性肺損傷[11]。在分析IL-1β與IL-18在急性肺損傷中的表達及臨床意義時證實細胞凋亡是急性肺損傷患者的重要病理機制之一，急性肺損傷的發生發展和IL-1β與IL-18的參與有關[12]。本研究也發現模型組大鼠的炎癥因子IL-2和IL-6水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復，且艾司洛爾組恢復更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調控大鼠肺泡炎癥因子水平的機制有關。氧化應激也參與了肺損傷的病理學過程，且藥物能夠通過調控氧化應激的異常狀態改善肺功能指標[13-14]。在分析膿毒癥大鼠模型心肌組織和肺組織中活性氧含量與組織損傷、細胞凋亡的相關性研究中也發現膿毒癥大鼠模型心肌組織和肺組織中反應氧自由基生成增多能夠引起組織損傷以及細胞凋亡[15]。艾司洛爾聯合米力農治療膿毒癥合并心功能不全的作用可能與其抑制機體炎癥反應、降低血乳糖來發揮作用[16]，且艾司洛爾提高肺葉切除患者早期肺氧合功能也與其抑制機體的炎癥反應機制有關[17]。艾司洛爾聯合去甲腎上腺素治療膿毒性休克患者心功能障礙和血流動力學異常也是通過抑制炎癥反應實現的[18]。本研究中也發現艾司洛爾能降低模型組血清中炎癥因子水平，提示其作用的機制也是與其調節炎癥因子水平異常有關。本研究也發現模型組大鼠的NOX2及NOX4水平均明顯升高；而地塞米松組和艾司洛爾組的上述指標得到明顯恢復，且艾司洛爾組恢復更明顯，提示艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調控大鼠肺泡氧化應激蛋白的水平有關。

因此，艾司洛爾能顯著改善膿毒癥急性肺損傷，可能與其調控大鼠肺泡炎癥因子及氧化應激蛋白的水平有關。