通咽噴霧劑對短暫性大腦中動脈栓塞模型大鼠吞咽功能的干預效應

袁清潔1，馮學功1，劉建勛，徐 立，郝文杰1，宋文婷，姚明江，王光蕊

腦卒中是神經源性口咽部吞咽障礙的常見原因[1]，腦卒中發生72 h內有一半以上的病人存在吞咽障礙，盡管很多急性腦卒中幸存者的吞咽障礙可短期內自發緩解，但仍有約50%的腦卒中后吞咽障礙病人吞咽功能恢復緩慢[2]。腦卒中后吞咽障礙可使吸入性肺炎等肺部并發癥的發生風險增加12倍[3]，且與營養不良、脫水密切相關，嚴重影響病人和看護者的生活質量，增加了病死率，延長了住院時間。因此，盡早采取有效的治療干預有望改善病人臨床結局。目前，針灸、行為干預(包括吞咽訓練和食物調整)、藥物、神經肌肉電刺激、咽部電刺激、物理刺激、經顱直流電刺激、經顱磁刺激等吞咽療法被用來治療腦卒中后吞咽障礙。然而，除針灸、行為干預療法可減少吞咽障礙和咽部電刺激可減少咽部傳送時間外，其他吞咽療法的有效性仍不確定[4]。另外一項Meta分析研究顯示，針灸治療腦卒中后吞咽障礙的短期療效和安全性肯定，但遠期療效尚無可靠的循證醫學證據支持[5]，而且針灸、吞咽訓練等的實際療效還與操作者專業技能水平[6]、病人的認知水平及依從性等有關，故對于初涉臨床的醫師或看護人員來說更是難以實施。

通咽噴霧劑(Tong-Yan Spray，TY Spray)是由生姜、威靈仙、肉桂三味中藥組成的復方噴霧制劑，已獲批國家發明專利(專利號ZL 2011 1 0035741.X)。在前期隨機對照臨床試驗研究中發現其治療腦卒中后吞咽障礙的有效率高達71.7%，且用藥方便，可控性及穩定性好，安全性高[7]。近年來，日本學者研究發現短暫性大腦中動脈栓塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型大鼠表現出吞咽潛伏期延長和吞咽次數減少的吞咽功能改變[8-9]，提示該模型可用于腦卒中后吞咽障礙的相關研究。因此，本研究即采用這一模型，從吞咽潛伏期、吞咽次數等吞咽直接指標和大鼠一般營養狀態、存活狀況、體重、進食水量等吞咽間接指標方面，研究通咽噴霧劑對tMCAO大鼠吞咽功能的干預效應，以期為后續研究提供借鑒與思路。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器、耗材、試劑 尼龍栓線(北京西濃科技有限公司2432-50A1型)，微量注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司，LSP01-1A型)；高精度張力換能器(北京新航興業科貿有限公司 JZ300型)；Powerlab生理實驗系統(PowerLab/8sp，ADIstruments公司)；軟件LabChart 7.37 (Chinese)(v7 for Windows，ADIstruments公司)；小動物麻醉機(美國MIDMARK公司，MatrxVIP3000型)；異氟烷(魯南貝特制藥有限公司，批號：64170901)。

1.2 通咽噴霧劑的組成 通咽噴霧劑以生姜、威靈仙、肉桂為原料制成。生姜辛散溫通；化痰開竅；利咽；威靈仙通行十二經絡，是古人治療魚骨梗喉的常用藥；再配伍以肉桂活血利咽通竅藥，共奏化痰祛瘀、利咽通竅之功。

1.3 實驗動物 SD大鼠，雄性，體重200～220 g，SPF級，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002。合格證號：11401500040369。

1.4 實驗方法

1.4.1 通咽噴霧劑的制備 制備工藝：由中國中醫科學院中藥研究所中藥制劑研究中心按既定工藝制作為成品(規格：每瓶25 mL，每毫升含生藥1 g)。先將生姜榨汁，備用；再將生姜渣與肉桂、威靈仙一起水蒸氣蒸餾提取揮發油，備用；藥渣加水煎煮，藥液過濾、濃縮，乙醇沉淀取上清藥液。精制藥液加入生姜汁、揮發油，增溶、矯味、灌裝，制得成品。

1.4.2 動物分組及給藥 將SD大鼠分為3組：Sham組(10只)、tMCAO組(30只)、tMCAO+TY Spray組(30只)。于造模后6 h時，tMCAO+TY Spray組大鼠給予通咽噴霧劑口咽部噴霧用藥，Sham組和tMCAO組給予等量生理鹽水。每日1次，每次1噴，約0.09 mL。

1.4.3 tMCAO模型的建立 4%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 mL/100 g)麻醉，以恒溫電熱毯將動物體溫維持在37 ℃，仰臥位固定大鼠，沿頸部中線作縱向切口約1 cm，鈍性分離右側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌的肌間隙，暴露右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，依次分離右側CCA、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，結扎ECA、CCA近心端，并在CCA靠近ICA、ECA分叉處預留活結，動脈夾夾閉ICA遠心端。于ECA與ICA分叉處作一“V”字形切口，插入尼龍線栓，松開ICA動脈夾，繼續插入線栓至稍有阻力后略回撤，線栓插入深度18～22 mm，尼龍線外留約1 cm，于遠心端預留活結處結扎CCA，用于固定線栓。縫合頸部切口，留置于外的尼龍線栓尾端用油性筆涂黑。90 min后將尼龍線栓輕輕提拉至略有阻力，表明線的頭端已抽出頸內動脈，實現再灌注，剪去撥出部分的線栓，完成手術。Sham組除不插入尼龍線栓外，其手術過程同模型組。

1.4.4 大鼠一般狀態、死亡率觀測 觀察一般營養狀況，包括毛發光澤度、精神、日常活動等情況，記錄死亡大鼠情況。

1.4.5 神經功能評估 以Longa 5分制為評分標準[10]：0分，無神經損傷癥狀(提示無神經功能缺損)；1分，不能完全伸展左側前爪(提示輕度局灶性神經功能缺損)；2分，向非缺血側轉圈(提示中度局灶性神經功能缺損)；3分，行走時向非缺血側傾倒(提示嚴重局灶性神經功能缺損)；4分，不能自發行走，意識昏迷(提示意識水平低下)。

1.4.6 大鼠體重、進食量、進水量測定 于7 d、14 d時，記錄大鼠體重及24 h的進食量和進水量。

1.4.7 吞咽功能評估 于14 d時，觀測大鼠50 s內由蒸餾水引發的吞咽潛伏期及吞咽次數。1.5%～2.0%異氟烷維持麻醉下，大鼠仰臥位固定，頸部中線切口約1 cm，暴露二腹肌前腹，高精度張力換能器一端連接二腹肌前腹，另一端與Powerlab生理實驗系統相連。經大鼠口腔插入直徑0.5 mm軟管直達舌根部，使用微量注射泵以3 μL/s的速度注入蒸餾水50 s，停止1 min后，再次重復以上步驟3次，LabChart軟件記錄大鼠50 s內的吞咽次數和從刺激開始至第1次吞咽發生的時間即吞咽反應時間。計算3次測量的平均數，即得平均吞咽潛伏期和吞咽次數。

1.5 統計學處理 應用 SPSS 20.0 統計軟件處理。計量資料若符合正態分布，采用單因素方差分析one-way ANOVA；若不符合正態分布或方差不齊，則采用非參數檢驗；計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

造模后6 h時，對各組大鼠進行神經功能評分，除去死亡大鼠及評分為0分、1分、3分、4分的大鼠，納入評分為2分的大鼠進入后續實驗。

2.1 大鼠一般狀態 tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠普遍表現為毛發干枯少澤、活動度減低、體型瘦弱、精神狀態不佳；tMCAO+TY Spray組少部分大鼠表現出一般狀態略好于tMCAO組的趨勢。

2.2 不同時點各組大鼠存活情況比較 6 h、24 h、7 d時，各組死亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時，與Sham組相比，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組死亡率增高，差異有統計學意義(P<0.05)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組死亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同時間各組大鼠存活情況

與Sham組同時間比較，1)P<0.05

2.3 大鼠體重變化情況 體重方面：各組大鼠基線體重組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；7 d、14 d時，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組體重均較Sham組明顯減輕，差異均有統計學意義(P<0.01)，tMCAO組與tMCAO+TY Spray組大鼠體重比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖1。體重增量/體重比較方面：7 d時，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組體重增量/體重均較Sham組明顯減小，差異均有統計學意義(P<0.01)，tMCAO組與tMCAO+TY Spray組大鼠體重增量/體重差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時，各組間大鼠體重增量/體重差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.01

2.4 大鼠進食量變化情況 進食量方面：7 d時，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進食量均較Sham組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組進食量比較差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時，tMCAO組大鼠進食量較Sham組明顯減少(P<0.01)，tMCAO+TY Spray組與Sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3。進食量/體重方面：7 d時，各組間大鼠進食量/體重差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時，tMCAO 組大鼠進食量/體重與Sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)，tMCAO+TY Spray組進食量/體重較Sham組增高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.05

2.5 大鼠進水量變化情況 進水量方面：7 d、14 d時，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進水量均較Sham組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組進水量比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖5。進水量/體重方面：7 d時，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組大鼠進水量/體重均較Sham組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，tMCAO組、tMCAO+TY Spray組兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；14 d時，tMCAO組大鼠進水量/體重較Sham組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，tMCAO+TY Spray組與Sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)，與tMCAO組比較，tMCAO+TY Spray組大鼠進水量/體重增高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6。

與Sham組比較，*P<0.01

與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與tMCAO組比較，#P<0.05

2.6 吞咽潛伏期、吞咽次數 14 d時，與Sham組相比，tMCAO組大鼠吞咽潛伏期延長，吞咽次數減少，差異有統計學意義(P<0.05)；tMCAO+TY Spray組吞咽潛伏期與Sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)，吞咽次數較Sham組增加(P<0.05)；tMCAO+TY Spray組吞咽潛伏期與tMCAO組比差異無統計學意義(P>0.05)，tMCAO+TY Spray組吞咽次數較tMCAO組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組14 d時由蒸餾水引發的吞咽潛伏期和吞咽次數比較(±s)

與Sham組比較，1)P<0.05；與tMCAO組比，2)P<0.01

3 討 論

線栓法制備大鼠tMCAO模型具有不開顱、對動物生理功能影響小、梗死效果確切、重復性好、能準確控制缺血及再灌注時間等優點。本研究中觀察到tMCAO大鼠表現出吞咽潛伏期延長和吞咽次數減少，這與前述日本學者報道的tMCAO大鼠吞咽功能改變相一致，說明tMCAO大鼠模型應用于研究神經源性吞咽障礙具有較好的可行性。另外，本研究還發現tMCAO大鼠還存在毛發干枯少澤、活動度減低、體型瘦弱、精神狀態不佳、死亡率高、體重下降和體重增量/體重比值下降、進食量減少、進水量減少和進水量/體重比值下降

等吞咽間接指標的異常，這也與腦卒中后吞咽障礙病人的臨床表現相一致。通咽噴霧劑干預后，tMCAO + TY Spray組大鼠未見吞咽潛伏期延長和吞咽次數減少，而表現為吞咽次數明顯增加，在進食量/體重指標方面雖與tMCAO大鼠相比差異無統計學意義，但表現出較好的改善趨勢，且在14 d時的進水量/體重與tMCAO組大鼠相比明顯增加。

由上可知，通咽噴霧劑在改善tMCAO大鼠吞咽功能方面效果明確，可有效促進吞咽反射的恢復。另外，通咽噴霧劑在改善單位體重進食量與單位體重進水量方面也有一定作用，這與吞咽反射的恢復密切相關。本研究還發現，在單位體重進食量和吞咽頻率指標方面，通咽噴霧劑干預組與Sham組相比明顯增加，考慮可能存在以下兩方面的原因：一是因吞咽頻率的增加進而引起相應的單位體重進食量的增加，二是因為通咽噴霧劑內含有生姜、肉桂等藥，可能促進了tMCAO大鼠的食欲，最終導致了單位體重的進食量增加。通咽噴霧劑起效的深層次機制仍需進一步研究驗證。

本研究的優點在于嚴格限定了納入研究的模型動物的神經功能評分水平，保證了研究結果的均一性及可靠性，局限性或不足是不能明確tMCAO大鼠模型中已排除的其他分值的大鼠的吞咽情況。具體來說，本研究中僅納入了術后神經功能缺損評分為2分的大鼠，剔除了1分和3分及以上的大鼠。主要原因在于：評分為1分的大鼠體重增長速度接近Sham組或正常大鼠，如不剔除組內大鼠體重差異較大，結果的一致性不好，不容易得出較為可靠的實驗結果，且本實驗采用的是單側大腦中動脈栓塞的方法造模，而非可以引起雙側皮質延髓束損傷的動物模型，評分為1分的大鼠可能表現不出明顯的吞咽功能障礙。若以體重、進食水功能作為觀測指標，考慮最好剔除評分為1分的大鼠。另外，本研究是基于文獻報道的新型腦卒中后吞咽障礙的大鼠模型，該模型大鼠的吞咽功能障礙發生在術后2周時，1周時尚未見到明顯的吞咽功能障礙。然而，評分為3分及以上的大鼠由于其神經功能缺損較重、一般狀況更差，往往于1周內死亡而導致實驗數據的偏倚，故亦將其剔除。本研究僅基于以上見于文獻報道的模型制作周期和對該模型的觀察把握，僅納入了神經功能缺損評分為2分的模型大鼠的數據，而對評分為1分或3分及以上大鼠，則需要設計更為嚴謹科學的實驗方案以進一步驗證。畢竟，臨床上此部分病人群體的吞咽功能障礙也是值得關注的，很有研究價值。