三種microRNA在胃癌患者中的表達及臨床意義①

王文尖 羅 瓊 覃世運 陳麗君 馬艷華

(海南省第三人民醫院放療科，三亞572000)

胃癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，我國每年胃癌新發人數約占全球胃癌新發人數的40%以上，全球胃癌死亡率在全部惡性腫瘤中居第二位[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類可調控轉錄水平基因表達的小分子非編碼RNA，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移等多種生物學過程中起著重要的作用[2]。近期的研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在結腸癌、乳腺癌和胰腺癌等患者中的表達與健康人群存在明顯不同，可能在惡性腫瘤的診斷、治療和預后方面扮演重要角色[3-5]。然而，目前血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌中表達和淋巴結轉移關系的研究較少。本研究通過檢測血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中的表達情況，分析其診斷胃癌及預測淋巴結轉移的價值，旨在為胃癌診斷、預后評估及靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年3月在海南省第三人民醫院做胃鏡檢查的門診及住院的胃部疾病患者528例，根據胃鏡檢查及組織病理學結果將受檢者分為胃癌患者116例和非胃癌患者412例。胃癌患者分為早期胃癌44例和進展期胃癌72例，有淋巴結轉移68例，無淋巴結轉移48例，其中男性71例，女性45例，年齡35～84歲，平均(61.75±11.26)歲。納入標準：①組織病理類型的判斷標準參照WHO胃癌的病理學分類；②術前均未接受放療、化療及免疫治療者；③未并發其他腫瘤者。排除嚴重肝腎疾病、內分泌代謝疾病及其他結締組織病。412例非胃癌患者(包括萎縮性胃炎、非萎縮性胃炎和胃潰瘍)男性260例，女性152例，年齡32～81歲，平均(59.84±12.16)歲。另選擇50例同期健康體檢正常者作為對照組，其中男性30例，女性20例，年齡38～80歲，平均(60.53±9.64)歲。各組性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，并簽署患者知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA提取 空腹抽取靜脈血3 ml置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2 500 r/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉移至1個EP管中，加入1 ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。從-70℃冰箱取出上述保存在EP管中的細胞，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。

1.2.2 引物設計與合成 miR-16引物：上游：5′-ATCAAGCTTATCAGACAAGC-3′，下游：5′-ATGTGCCCGGTCAGAGGC-3′；miR-93引物：上游：5′-ATTC-AGCTAATCAGACTGGC-3′，下游：5′-ATCTGCAAGGTCAGAGTG-3′；miR-196b引物：上游：5′-ATCATCGAGCTGACTACTCG-3′，下游：5′-GCTTGCGCAGAGTAGTAG-3′。

1.2.3 miRNA逆轉錄及RT-PCR 應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉錄已定量的RNA，選用U6作為內參，反應體系為15 μl，反應參數為：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應體系為20 μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μl，cDNA 1.33 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μl，ddH2O 7.67 μl，混合后離心放入定量 PCR儀。擴增條件為：95℃預熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，45個循環，最后38℃延伸5 s，實驗重復3次。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct U6。

2 結果

2.1 各組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平比較 胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于非胃癌組和對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。非胃癌組與對照組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 早期胃癌組、進展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平比較 進展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于早期胃癌組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.3 淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平比較 淋巴結轉移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

2.4 血清miR-16、miR-93及miR-196b對胃癌的診斷價值 血清miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的最佳截斷值分別為11.83、2.85、2.14。三項聯合診斷胃癌的AUC(95%CI)明顯高于單項miR-16、miR-93及miR-196b，差異有統計學意義(Z=4.705，6.928，6.314，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每兩個指標的聯合檢測對胃癌診斷的敏感度和特異度均明顯低于三項指標聯合檢測。見表4、圖1。

2.5 血清miR-16、miR-93及miR-196b預測胃癌淋巴結轉移的價值 血清miR-16、miR-93及miR-196b預測胃癌淋巴結轉移的最佳截斷值分別為21.50、6.80、4.36。三項聯合預測胃癌淋巴結轉移的AUC(95%CI)為0.960(0.905～0.997)明顯高于單項miR-16[0.904(0.847～0.960)]、miR-93[0.862(0.806～0.919)]及miR-196b[0.830(0.772～0.891)]，差異有統計學意義(Z=4.637，6.803，7.204，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每兩個指標的聯合檢測對預測淋巴結轉移的敏感度和特異度為(87.5%和82.4%，85.6%和81.6%，84.8%和80.7%)均明顯低于三項指標聯合檢測(94.0%和87.5%)。見表5、圖2。

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bControl group505.96±1.240.78±0.120.36±0.05Non gastric cancer group4126.12±1.350.90±0.150.41±0.07Gastric cancer group11619.24±6.821)2)5.06±0.831)2)3.85±0.641)2)F14.2769.75310.140P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs control group,1)P<0.05；vs non gastric cancer group,2)P<0.05.

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bEarly gastric cancer group4413.38±4.503.12±0.632.38±0.35Advanced gastric cancer group7224.70±9.167.85±1.405.30±0.77t12.3059.2037.246P<0.001<0.001<0.001

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bNo lymph node metastasis group4812.14±4.202.85±0.602.14±0.30Lymph node metastasis group6826.28±8.508.16±1.545.75±0.93t15.30610.4279.148P<0.001<0.001<0.001

表4 血清miR-16、miR-93及miR-196b對胃癌的診斷價值

Tab.4 Diagnostic value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictive value(%)Negativepredictive value(%)miR-1611.830.870(0.810-0.932)<0.00185.683.485.883.6miR-932.850.812(0.754-0.873)0.00479.478.376.282.7miR-196b2.140.840(0.782-0.902)<0.00180.682.785.477.5Three combination-0.928(0.873-0.984)<0.00191.584.287.588.6

表5 血清miR-16、miR-93及miR-196b預測胃癌淋巴結轉移的價值

Tab.5 Value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in predicting lymph node metastasis of gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positive predictivevalue(%)Negative predictivevalue(%)miR-1621.500.904(0.847-0.960)<0.00187.485.088.384.5miR-936.800.862(0.806-0.919)<0.00185.381.279.388.0miR-196b4.360.830(0.772-0.891)<0.00179.581.484.376.7Three combination-0.960(0.905-0.997)<0.00194.087.590.891.2

圖1 miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的ROC曲線Fig.1 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b in diagnosing gastric cancer

圖2 miR-16、miR-93及miR-196b預測胃癌患者淋巴結轉移的ROC曲線Fig.2 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b predict lymph node metastasis in gastric cancer patients

圖3 血清miR-16與miR-93、miR-196b的相關性Fig.3 Correlation between serum miR-16 and miR-93，miR-196b

2.6 胃癌患者血清miR-16與miR-93、miR-196b的相關性 Pearson相關分析顯示，胃癌患者血清miR-16與miR-93呈正相關(r=0.764，P<0.01)，miR-16與miR-196b呈正相關(r=0.835，P<0.01)，miR-93與miR-196b呈正相關(r=0.707，P<0.01)。見圖3。

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率近年來明顯升高且呈年輕化趨勢，早期胃癌缺乏一定的癥狀和體征，難以發現，而出現明顯的臨床癥狀時，多屬于進展期胃癌或伴有遠處轉移，從而導致患者的死亡率較高、預后較差。因而，胃癌患者早期診斷和預測淋巴結轉移對其救治顯得尤為重要。胃癌的發生發展和轉歸是一個多階段、多因素的連續性過程，其發病機制復雜，涉及蛋白質編碼的原癌基因和抑癌基因的遺傳學和表觀遺傳學改變。miRNA是一類內源性的具有調控功能的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，長度約為20～24個核苷酸，通過在轉錄后水平調控靶基因的表達參與各種重要的生物學過程，如細胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、腫瘤轉移、血管形成及免疫應答等[6，7]。有研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在多種惡性腫瘤中異常表達，且不同惡性腫瘤組織miR-16、miR-93及miR-196b的表達水平不同，miR-16、miR-93及miR-196b對惡性腫瘤早期診斷、轉移、分期和預后評估等方面具有重要的提示作用[8-10]。本研究顯示，胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于非胃癌組和對照組，而非胃癌組和對照組之間差異無統計學意義。提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中異常高表達，可能通過發揮癌基因的作用來調節胃癌的發生發展過程。Liu等[11]研究發現，miRNA在胃癌組織中的表達水平明顯高于相應的正常組織，其表達水平越高，淋巴結轉移越頻繁，進展期越高，miRNA的高表達是影響患者總生存率的獨立預后因素。本研究中進展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于早期胃癌組，淋巴結轉移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平均明顯高于無淋巴結轉移組，分析原因可能是病情進展期或存在淋巴結轉移的患者腫瘤負荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進入血液，同時可抑制機體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達，進而導致機體microRNA表達水平異常升高。這提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌發生發展過程中發揮著重要的作用，其水平升高可能促進胃癌的病情進展和淋巴結轉移。Zhang等[12]研究也顯示，miR-16與胃癌臨床病理特征相關，未來在胃癌早期篩查和進展評估等應用中具有巨大潛力。Chen等[13]研究發現，miR-93在胃癌，尤其是晚期和轉移性胃癌中顯著升高，提示miR-93可能在胃癌的發生發展中起重要作用，miR-93高表達可作為胃癌預后不良的新型標志物。另有研究認為，miR-196b表達水平與胃癌患者的臨床分期、淋巴結轉移及預后密切相關，可能是胃癌新的潛在診斷和預后分子標志物及治療靶點[14]。由此推測miR-16、miR-93及miR-196b與胃癌發生、發展密切相關，有可能是一類新型標志物，在胃癌的發病機制中發揮關鍵作用。本研究應用ROC曲線分析，結果顯示miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的最佳截斷值分別為11.83、2.85、2.14，預測胃癌淋巴結轉移的最佳截斷值分別為21.50、6.80、4.36，三項聯合診斷胃癌和預測胃癌淋巴結轉移的曲線下面積均最大，其敏感度和特異度均最高。miR-16、miR-93及miR-196b中每兩個指標的聯合檢測對胃癌診斷及預測淋巴結轉移的敏感度和特異度均明顯低于三項指標聯合檢測。相關分析顯示，胃癌患者血清miR-16與miR-93、miR-196b均呈正相關(r=0.764、0.835，P<0.01)。這說明miR-16、miR-93及miR-196b可作為診斷胃癌發生和淋巴結轉移的新型生物標志物，三項聯合檢測有助于提高胃癌診斷及預測淋巴結轉移的準確性。Zhu等[15]研究表明，血清miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451及miR-486-5p表達水平上調與胃癌發生、發展有關，其診斷胃癌的AUC均較好，這五個miRNA可作為檢測早期胃癌的潛在非侵入性生物標志物。亦有研究發現，血清miR-93在胃癌患者中明顯升高，且在有淋巴結轉移患者中升高更顯著，有可能作為胃癌早期診斷和預后預測的生物標志物[16]。由此可見，血清miR-16、miR-93及miR-196b檢測為胃癌診斷和轉移提供了一種非侵入性的方法，在未來有較廣闊的應用前景。

綜上所述，血清miR-16、miR-93及miR-196b表達水平在胃癌患者中明顯上調，且與胃癌發生發展相關，三項聯合檢測有助于提高胃癌診斷及預測淋巴結轉移的準確性，同時也為闡明胃癌癌變的分子機制提供新的線索。但本研究為單中心的臨床研究，其結果尚需多中心、大樣本的臨床對照研究來驗證，從而進一步推動miRNA用于胃癌診斷及預后監測。