量子點標記技術在脂蛋白相關磷脂酶A2中的應用

蔡 甜 陳振華 牛英波 唐 波

1.廣東省佛山市南海區人民醫院，廣東佛山 528200；2.南京諾維贊醫療科技有限公司，江蘇南京 210034

心腦血管病是當今威脅人類健康的主要疾病。70% ～ 80%的心腦血管事件是在不穩定動脈粥樣斑塊破裂基礎上血栓形成導致的[1-2]。Lp-PLA2 是血管炎癥的特異性生物標志物，在不穩定的動脈粥樣硬化斑塊中高表達[3-4]，能夠有效預測高危人群發生心腦血管急性不良事件的概率[5]。量子點是一種半導體熒光材料，由于其直徑在1 ～100nm 之間，因此具有很多常規熒光材料所不具有的性質[6-11]。隨著近年來量子點各項技術水平不斷發展，量子點已經廣泛應用于生物標記、蛋白質檢測等領域[12-16]。本研究評估了一種新型量子點Lp-PLA2 熒光免疫檢測試劑，針對該試劑的精密度、定量限、線性范圍進行檢驗，并選擇動脈粥樣硬化患者、健康人的血清Lp-PLA2 含量以評估該試劑準確性和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

Lp-PLA2 量子點熒光免疫檢測試劑選擇南京諾唯贊醫療科技有限公司生產，批號2017120501，型號為AFS-1000。質控品由南京諾唯贊醫療科技有限公司提供，批號為20180106。

1.2 方法

1.2.1 精密度 每天各測定4 次或同一天測定20次2 個不同濃度水平質控品：150、350ng/mL。共連續5d 進行檢測，計算各個檢測均值、標準差、變異系數（CV），確定日內精密度、日間精密度。

1.2.2 建立定量限（LOQ） 取五份Lp-PLA2 的低值樣本，將各個樣本重復20 次進行檢驗，記錄檢測值、精密度。

1.2.3 線性范圍驗證 選擇1 份接近Lp-PLA2試劑上限濃度水平樣本（H）和1 份處于檢出限附近低值濃度水平樣本（L），以H、1H+4L、2H+3L、3H+2L、4H+1L、L 方式進行稀釋，重復檢測并計算均值，與預期濃度水平進行比較。

1.2.4 Lp-PLA2 量子點熒光免疫檢測試劑的臨床驗證 分別選擇50 例頸動脈超聲確診的患有動脈粥樣硬化，且存在不穩定斑塊的患者以及40 例健康人。使用Lp-PLA2 量子點熒光免疫試劑進行檢測，比較兩組人群間Lp-PLA2 水平的差異。

2 結果

2.1 精密度

使用熒光定量分析儀對樣本進行統一檢測，檢測結果顯示精密度均＜10%（廠家聲明值），符合精密度要求。見表1。

表1 Lp-PLA2量子點檢測試劑精密度驗證

2.2 定量限

選取5 個濃度的新鮮血清樣本，每個樣本進行20 次重復檢測，定量限驗證結果表明22.1ng/mL 的樣本檢測精密度為17.3%，而15.9 ng/mL 樣本的檢測精密度為25.1%，超出范圍，因此確定該試劑的定量限為22.1ng/mL。見表2。

表2 Lp-PLA2量子點檢測試劑重復性驗證

2.3 線性范圍驗證結果

因無法獲得濃度值接近1000ng/mL 的臨床樣本，因此分別選取Lp-PLA2 濃度為35.1ng/mL 和784.3ng/mL 的血液樣本進行檢測，按照混合比例不同重復多次檢測，使用量子點Lp-PLA2 檢測試劑檢3 次。經處理，檢測平均值與理論值之間的線性方程為y=0.9733x+4.7202，相關系數為0.998，因此量子點Lp-PLA2 試劑的線性范圍為 35.1 ～784.3ng/mL。見表3。

表3 Lp-PLA2量子點檢測試劑線性范圍驗證

2.4 Lp-PLA2量子點熒光免疫檢測試劑的臨床驗證

比較動脈粥樣硬化患者和健康人群血清Lp-PLA2 水平（見圖1）。兩組間Lp-PLA2 水平有顯著差異。

圖1 動脈粥樣硬化患者與健康人Lp-PLA2 血清含量比較

3 討論

本研究對Lp-PLA2 量子點熒光免疫檢測試劑進行了性能驗證和評估，其結果討論如下。

3.1 精密度評價

該量子點Lp-PLA2 檢測試劑的日內精密度和日間精密度均在10%以內，能夠準確檢測樣本中的Lp-PLA2 含量，滿足臨床動脈粥樣硬化患者診斷需求。

3.2 定量限評價

該方法檢測Lp-PLA2 的定量限在22.1ng/mL以下，而檢測健康人群的Lp-PLA2 濃度均在50ng/mL以上，因此該試劑的定量限能夠滿足臨床診斷需求。

3.3 線性范圍評價

該方法檢測Lp-PLA2 的線性范圍為35.1 ～784.3ng/mL。因未能收集到接近1000ng/mL 的樣本，因此無法驗證試劑線性范圍上限是否能夠達到1000ng/mL。但通過檢測動脈粥樣硬化患者的樣本，發現患者Lp-PLA2 水平均在600ng/mL 以下，因此該試劑盒的線性范圍能夠滿足準確評估粥樣斑塊穩定性的需求。

3.4 臨床驗證

利用該試劑檢測存在易損斑塊的動脈粥樣硬化患者和健康人血清Lp-PLA2 濃度后發現兩種人群Lp-PLA2 水平存在顯著差異，說明Lp-PLA2 量子點檢測試劑能夠準確評估病人的疾病狀態，并對臨床治療提供參考。

傳統危險因素，如血脂、血壓、血糖、吸煙和年齡等雖然都是動脈粥樣硬化性疾病的危險因素[17]，但臨床研究也表明很多發生心?；蛘吣X梗的病人并非存在全部危險因素，只有聯合多種危險因素聯合評估才能較好地預測患者風險[18]。Lp-PLA2 能夠直接反映動脈粥樣斑塊的穩定性，是心?；蚰X梗風險的直接評估指標[19]。本研究評估的Lp-PLA2 量子點熒光免疫檢測試劑具有良好的檢測性能，臨床研究也表明該試劑能夠準確評估患者的動脈粥樣硬化狀態。該方法在動脈粥樣硬化高?；颊叩娘L險評估中具有極大的應用潛力。