白樺脂醇對AGEs誘導H9C2心肌細胞自噬的影響①

羅 萍 杜娟娟 杜 松

(河南省人民醫院心內科，鄭州450003)

細胞自噬是一種存在于真核生物中高度保守的代謝過程[1]。通過清除體內異常的蛋白質和受損細胞器，參與細胞物質代謝平衡的調節[2]。細胞自噬在機體炎癥、免疫、腫瘤、神經退行性疾病和心血管疾病的發生發展過程中發揮著重要的作用[3]。心血管疾病是引起人類死亡的最主要原因，患病的風險隨著年齡增長而增加。據統計2012年有1 750萬人死于心血管疾病，占全球死亡人數的30%以上[4]。越來越多的證據表明，在心血管系統中，正常的自噬對維持血管和心臟的穩態和功能至關重要，然而自噬缺陷或過度自噬會造成心血管疾病的發生，如心力衰竭、心肌肥大和動脈粥樣硬化[5]。晚期糖基化終產物(Advanced glycation end products，AGEs)是糖尿病血管并發癥的一大特征[6]。AGEs及其受體相互作用，在體內誘發氧化應激，促進炎性反應，加速心血管疾病的發生[7]。大量研究發現，AGEs通過損傷組織細胞，能顯著提高細胞自噬水平[8]。白樺脂醇是來源于白樺樹皮的一種羽扇烷型三萜類化合物。近年來，白樺脂醇在抗炎、抑菌、抗腫瘤和抗HIV等方面效果明顯，因而廣受關注[9,10]。近期有研究發現，白樺脂醇對受損的心肌具有保護作用[11]，但是白樺脂醇對心肌細胞自噬的影響還未見相關報道。本文使用AGEs誘導H9C2心肌細胞自噬，探究白樺脂醇對細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 白樺脂醇(純度>98%，cas:473-98-3)購自道斯夫生物；AGE-BSA(2221-10)購自艾美捷科技有限公司；巴佛洛霉素A(Bafilomycin,Baf-A1)購自美國Selleck公司；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)和胰酶購自Hyclone公司；盤尼西林(Penicillin)和鏈霉素(Streptomycin)購自Thermo Fisher Scientific；CCK8試劑盒購自默沙克生物；肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和心肌肌鈣蛋白(Myocardial troponin，cTnⅠ)ELISA檢測試劑盒購自羅氏；BCA試劑盒購自北京天根生物；Beclin1、P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT兔抗大鼠一抗和羊抗兔二抗及顯影液購自美國Abcam；H9C2細胞購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1細胞的培養及分組 H9C2細胞復蘇后，加入DMEM+10%FBS+100 U/ml盤尼西林+100 μg/ml鏈霉素的培養基，于37℃、5%CO2的生化培養箱中培養。細胞隨機分成正常H9C2組，AGEs組(100 mg/L)，低劑量加藥組(5 μmol/L)，中劑量加藥組(10 μmol/L)，高劑量加藥組(20 μmol/L)。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 取對數生長期的H9C2心肌細胞，消化后，離心棄上清，用培養基將細胞懸液的濃度調整為5×104個/ml，96孔板中加100 μl 細胞懸液。同時加入不同相應濃度白樺脂醇和(或)AGEs，空白組使用不加藥物的溶液。培養箱中貼壁生長24 h，加入10 μl CCK8。將培養板在培養箱中孵育2 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3次。

1.2.3酶聯免疫吸附實驗 收集H9C2細胞，計數后，用預冷的PBS洗3次，加細胞裂解液，超聲后破碎，12 000 r/min離心15 min，收集上清備用?？贵w包被反應孔，加稀釋后的待檢測樣品，設置空白組和對照組，置于37℃孵育1 h。加入稀釋后的酶標抗體，37℃孵育1 h；加底物于37℃反應15 min后，終止反應。以空白組調零后，酶標儀下檢測450 nm處光吸收值，根據標準曲線計算酶的含量。

1.2.4Western blot 取對數生長期的H9C2細胞，稀釋后接種于含AGEs和(或)不同濃度的白樺脂醇的培養基中培養48 h后。收集細胞并計數，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液處理H9C2細胞。BCA法測定蛋白濃度，并調整蛋白濃度，制備蛋白樣品。等量蛋白樣品經12%的SDS-PAGE凝膠分離后轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，室溫下孵育二抗1 h，TBST洗膜后加顯色液顯影。凝膠成像系統中觀察結果并拍照，使用Image-pro plus軟件分析蛋白條帶灰度。

1.2.5免疫熒光染色 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗；用PBS配制的0.5% Triton X-100室溫下通透20 min。山羊血清室溫封閉30 min；除去封閉液，加稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。PBST清洗，加稀釋好的帶熒光標簽的二抗，室溫下孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，用PBST清洗除去DAPI，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3統計學分析 使用SPSS18.0統計軟件和GraphPad Prism 5分析數據和作圖。數據是3次實驗的平均標準偏差(SD)。兩組之間的差異用獨立的t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1白樺脂醇促進AGEs作用下H9C2心肌細胞的活性 AGEs組細胞增殖倍數明顯低于正常H9C2組(圖1，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2細胞后，細胞的增殖倍數顯著升高，且增殖倍數隨著白樺脂醇濃度的增加而升高(圖1，P<0.01)。實驗結果表明，白樺脂醇促進AGEs作用下H9C2心肌細胞的活性。

2.2白樺脂醇對心肌酶表達的影響 ACEs組與H9C2組相比較，細胞中Mb、CK-MB和cTnⅠ的表達顯著上升(圖2，P<0.01)。將白樺脂醇與ACEs共同作用于H9C2細胞后，細胞中Mb、CK-MB和cTnⅠ的表達明顯下降；且白樺脂醇的濃度越高，降低的效果越明顯(圖2，P<0.01)。實驗結果表明，白樺脂醇抑制AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷。

2.3白樺脂醇對自噬相關蛋白表達的影響 正常H9C2經AGEs處理后，Western blot檢測蛋白表達，發現Beclin1的表達顯著上調，P62的表達顯著下調，LC3Ⅱ的表達上調，使LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比率顯著上升，提示細胞自噬水平升高(圖3A，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2細胞后，Beclin1表達顯著下調，P62表達顯著上調，而LC3Ⅱ的下調和LC3Ⅰ的上調，使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ顯著下降(圖3A，P<0.01)。向上述各組細胞中加入巴佛洛霉素A1，檢測結果顯示，AGEs組與H9C2組相比，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ顯著上升；不同濃度白樺脂醇處理細胞后，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ顯著降低(圖3C，P<0.01)，且上述作用均具有白樺脂醇劑量依賴效應。

2.4白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2心肌細胞自噬體的形成 免疫熒光染色結果顯示，AGEs處理H9C2心肌細胞后，LC3光點呈現團狀，光點數目顯著上升，表明有大量自噬體形成(圖4，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同處理H9C2細胞后，LC3光點隨著白樺脂醇濃度的增加而顯著減少(圖4，P<0.01)。實驗結果表明，白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2心肌細胞自噬體的形成。

圖1 白樺脂醇對心肌細胞細胞活性的影響Fig.1 Effect of Betulin on activity of myocardial cellsNote: Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group，##.P<0.01.

圖2 白樺脂醇抑制AGEs對H9C2心肌細胞損傷的誘導作用Fig.2 Betulin inhibits H9C2 myocardial cell injury induced by AGEsNote: Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group，##.P<0.01.

2.5白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2細胞PI3K和AKT的活化 AGEs處理H9C2細胞后，PI3K和AKT蛋白總量未見明顯變化，p-PI3K 和p-AKT則顯著上升，使p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著提高(圖5，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2心肌細胞后，PI3K和AKT蛋白總量沒有明顯變化，p-PI3K和p-AKT的含量隨著白樺脂醇濃度的增加而降低，使p-PI3K和p-AKT在細胞中占比顯著下降(圖5，P<0.01)。實驗結果表明，白樺脂醇降低PI3K和AKT的磷酸化水平，在起始階段抑制AGEs誘導的H9C2細胞自噬。

圖3 白樺脂醇對自噬相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Betulin on expression of autophagy related proteinsNote: A and B.Effects of betulin on Beclin1,P62 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ without the addition of Bafilomycin A1;C and D.Eeffects of betulin on LC3Ⅱ/LC3Ⅰ in the presence of Bafilomycin(200 nmol/L).Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

圖4 免疫熒光檢測LC3的表達Fig.4 Expression of LC3 was determined by immunofluorescenceNote: Compared with the H9C2 group,**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

圖5 白樺脂醇對AGEs作用下H9C2細胞PI3K,AKT表達及其磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of Betulin on expression and phosphorylat-ion level of PI3K and AKT in AGEs treated H9C2 cellsNote: Compared with the H9C2 group,**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

3 討論

細胞自噬的是一種溶酶體降解途徑，對生存、分化、發育和機體穩態至關重要[12]。研究發現，自噬在許多疾病如感染、神經退行性疾病、癌癥中起到保護作用[3,13]。當機體細胞自噬水平發生異常時，會誘發多種疾病，如細胞自噬減弱與阿爾茲海默癥的發生密切相關[14,15]。生長因子、細胞內氨基酸水平、葡萄糖水平、DNA損傷、氧自由基等均可引起細胞自噬水平的變化。白樺脂醇是一種具有多種生物活性的天然提取物。大量研究顯示，許多天然藥物能促進細胞的增殖速率，如Lai等[16]發現，原花青素能抑制氧化應激反應，促進Th17和Treg細胞增殖，從而治療銀屑病。本文研究結果顯示，白樺脂醇能提高AGEs作用下H9C2心肌細胞的活性。

當AGEs在體內含量異常升高時，會損傷血管內皮，促進白細胞黏附和血小板數量增加，促進動脈粥樣硬化、糖尿病血管并發癥，嚴重損害心血管系統。當心肌受到損傷時，心肌酶譜系列酶的濃度會有不同程度的升高，因而心肌酶譜常用來檢測心肌損傷的情況，對心肌梗死的診斷具有參考價值。Mb、CK-MB和cTnⅠ是常見的心肌損傷標記物。許多研究證實，白樺脂醇能降低心肌組織中CK的表達。如Xia等[17]的研究結果顯示，白樺脂醇能降低乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(Creatinekinase,CK)的活性，對心肌缺血再灌注大鼠具有保護作用。與前面研究結果一致，本研究結果顯示，白樺脂醇能降低AGEs作用下H9C2心肌細胞Mb、CK-MB和cTnⅠ的濃度，緩解AGEs誘導的H9C2心肌細胞的損傷。

細胞自噬是一個多基因參與的高度保守的復雜過程。Beclin1、P62和LC3是自噬發生過程中的3個重要蛋白。Beclin1是酵母自噬相關基因Atg6的同源基因，在自噬的起始階段通過招募其他自噬相關基因形成復合物，介導其定位于自噬泡，調控自噬的起始[18,19]。LC3作為自噬標記物，在自噬體膜延伸階段，LC3Ⅰ經過酶切轉化為LC3Ⅱ,LC3Ⅱ與磷脂酰乙醇胺結合后,定位于自噬體膜上[20]。P62與LC3形成復合體，隨著自噬的發生被降解，因此細胞內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和P62的含量作為自噬發生的標志物[21]。Lin等[22]研究發現，白樺脂醇在小鼠體內具有鎮痛、降低炎性反應的作用，同時抑制自噬水平。本研究結果顯示，白樺脂醇添加到AGEs處理的H9C2心肌細胞后，Beclin1表達下調，P62含量上升，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下降，提示白樺脂醇可能會抑制AGEs誘導的H9C2心肌細胞自噬。

細胞自噬發生時，先形成一個杯狀的前自噬體，吞噬聚集的蛋白和受損的細胞器，隨后閉合成完整的自噬體，自噬體與溶酶體融合后，內容物在溶酶體作用下消化。正常生理狀態下，LC3在胞質中呈現彌散的狀態。當細胞發生自噬時，LC3Ⅱ與磷脂酰乙醇胺結合定位于自噬體膜[23]。通過免疫熒光染色，根據熒光顆粒的聚集程度和分布，不僅反映出細胞中LC3蛋白的表達情況，還能判斷細胞自噬發生的狀態。免疫熒光檢測LC3實驗結果顯示，白樺脂醇能抑制AGEs誘導的H9C2心肌細胞自噬體的形成。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，通過激活AKT從而參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞的功能調節[24,25]。大量研究證實，白樺脂醇對PI3K/AKT信號通路具有調節作用。如Jin等[26]發現，從黃蓮根中提取的白樺脂醇通過調節PI3K/AKT信號通路，能夠抑制甲基黃嘌呤誘導的黑色素的生成。Majeed等[27]發現，白樺脂醇通過抑制AKT信號通路從而抑制癌細胞的擴散。Ci等[28]研究表明，白樺脂醇通過調節AKT依賴的信號通路從而抑制內毒素誘導的炎性反應。本文研究結果表明，白樺脂醇可能抑制AGEs對H9C2心肌細胞PI3K和AKT的磷酸化激活作用。

綜上所述，白樺脂醇能促進H9C2細胞增殖，下調Beclin1的表達，抑制AGEs誘導的H9C2細胞自噬，緩解心肌細胞的損傷，其作用機制可能與調節PI3K/AKT通路的活化有關。下一步研究將探討白樺脂醇在大鼠心肌梗死模型中對細胞自噬及氧化應激反應的影響。