糖尿病腎病患者外周血微小RNA-21表達與腎間質損傷的關系及意義①

秦 鳳 張惠莉

(青海大學附屬醫院內分泌科，西寧810001)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，也是臨床導致終末期腎臟疾病的首要原因[1]。并發癥早期防治一直是糖尿病臨床管理的重中之重，越來越多的證據表明[2，3]，從細胞、分子和基因水平上尋找敏感標志物對糖尿病微血管病變的早期預測具有積極意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性的非編碼小分子RNA，廣泛參與了生物體生長發育、生理功能和病理機制的調控。其中miR-21主要參與纖維化損傷，纖維化損傷是在各種急慢性刺激的誘導下而發生的細胞壞死、細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)增多和纖維結締組織沉積的病理過程，持續發展可導致器官衰竭[4]。研究已證實在腎細胞癌中，轉化生長因子TGF-β誘導的纖維化損傷與miR-21之間存在相互調節的負反饋機制，在糖尿病腎病大鼠模型中也發現了類似現象，miR-21高表達可誘導腎小球硬化和腎間質纖維化損傷，這一功能依賴于與TGF-β/smad3通路的協同作用[5]。但目前多數研究集中于動物或細胞實驗，對臨床患者的研究尚不多見，本研究重點考察糖尿病腎病患者外周血miR-21表達水平與腎間質損傷之間是否存在相關性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 本研究經本院倫理委員會批準，所有受試者均自愿簽署知情同意書。病理對象為本院2016年1月～2018年1月收治的145例糖尿病及DN患者；其中男77例，女68例；年齡33～75歲，平均(45.5±10.5)歲。診斷標準:①2型糖尿病診斷參照WHO 1999年制定的糖尿病診斷標準；②糖尿病腎病參照糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)[6]。納入標準:①糖尿病為2型糖尿病；②糖尿病腎病Mogensen分期Ⅱ～Ⅳ期；③身體質量指數18.5～27 kg/m2。排除標準:①泌尿系統結石、囊腫或其他占位性病變；②腦梗死；③免疫系統缺陷；④近6個月有激素類藥物或免疫調節劑應用史；⑤過敏體質或存在過敏史。根據疾病嚴重程度分為三組:中重度DN 41例，為Mogensen分期Ⅲ～Ⅳ期病例；輕度DN 44例，為Mogensen分期Ⅱ期病例；單純糖尿病60例，指尚無糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等糖尿病微血管并發癥的糖尿病患者；另以60例同期入院體檢的健康志愿者為對照組；各組患者基礎資料如表1所示，在年齡、性別、體質量指數、基礎合并癥方面，差異無統計學意義(P>0.05)；糖尿病病程、空腹血糖值(Blood sugar，BS)和糖化血紅蛋白A1c(Glycated hemoglobin A1c,HBA1c)的差異有統計學意義(P<0.05)。

1.1.2主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀(LightCycler480，上海羅氏)；全自動酶聯免疫分析儀(BIOBASE2000，山東博科)；全自動化學發光免疫分析儀(UniCel Dxl 800，德國貝克曼庫爾特)；水平電泳儀(DYCZ-24K，北京六一儀器廠)；紫外-可見光分光分析系統(Thermo E 300，北京百道亨儀器設備有限公司)；全血microRNA快速提取試劑盒(D1803，新海基因檢測有限公司)；microRNA反轉錄試劑盒(D1801，新海基因檢測有限公司)；熒光定量PCR Mix(A2201，新海基因檢測有限公司)；引物由新海基因檢測有限公司設計合成；腎功能檢測試劑購自透景生命科技股份有限公司；纖維化標志物檢測試劑購自杭州泰格醫藥科技有限公司。

1.2方法

1.2.1miR-21表達測定方法 所有受試者，均取晨空腹肘靜脈血，分為兩管，一管采用熒光定量PCR實驗測定miR-21表達，另一管分離血清測定腎功能標志物和纖維化損傷標志物。熒光定量PCR實驗步驟:①采用血液microRNA快速提取試劑盒提取外周血中的microRNA，操作步驟嚴格參照說明書，最終經吸附柱RA洗脫后，收集到濃度較高、質量較穩定的microRNA。瓊脂糖凝膠電泳，紫外吸收測定法鑒定完整性和純度，完整性合格標準:28 s 和18 s條帶清晰，28 s亮度約為18 s的1.5～2.0倍；純度合格標準:OD260/OD280=1.8～2.1。②反轉錄(RT)實驗生成cDNA，按照microRNA反轉錄試劑盒配置體系，置于熒光定量PCR儀反應，反應條件:16℃×30 min→42℃×40 min→85℃×5 min。③所得RT產物自動進行實時定量熒光PCR反應，以U6為內參，miR-21和U6分開測定，加入miR-21或U6上下游引物和熒光定量PCR Mix配置體系，PCR產物的溶解曲線觀察擴增產物的特異性，根據擴增曲線自動計算表達量。

表1 各組患者基礎資料比較

Tab.1 Basic data compare between groups

GroupsnAge(yr)Gender(M/F)Body massindex(kg/m2)Basal complications[n(%)]Coronary heart diseaseHypertensionHyperlipaemiaDuration ofdiabetes (yr)BS(mmol/L)HBA1c(%)Controls6045.8±10.435/2523.5±2.3746--5.24±0.745.85±0.74Diabetes6046.1±12.230/3024.1±2.45694.58±0.657.84±0.886.85±0.93Mild DN4445.2±13.125/1923.8±2.15256.33±0.848.05±0.757.31±0.86 Severe DN4145.4±11.522/1923.6±2.24647.52±1.028.08±1.127.85±0.93F/χ2-0.9520.9520.0680.4013.1850.95524.18816.52627.632P-0.4170.8130.9760.9400.3640.812<0.001<0.001<0.001

1.2.2血清學標志物測定方法 所得血液樣品，室溫靜置1 h，4 000 r/min離心15 min分離血清，離心半徑8 cm。采用全自動酶聯免疫分析儀和腎功能檢測試劑測定血清腎功能標志物血肌酐、尿氮素、尿酸及胱抑素C(胱抑素)水平，檢測原理依次為肌氨酸氧化酶法、免疫比濁法、尿酸酶法和免疫比濁法；采用化學發光免疫分析儀和纖維化標志物測定試劑測定纖維化損傷標志物轉化生長因子(TGF-β)、透明質酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)。

2 結果

2.1各組受試者外周血miR-21表達結果 如圖1所示，miR-21和內參U6熒光定量PCR實驗的溶解曲線顯示出良好的單峰，證明所得產物特異性良好，最終結果顯示輕度DN和中重度DN的miR-21 mRNA表達水平高于對照組和單純糖尿病，中重度DN組的miR-21 mRNA表達水平高于輕度DN，差異有統計學意義(P<0.05)；見表2。

2.2各組受試者腎功能測定結果 單純糖尿病、輕度DN和中重度DN的血肌酐、尿氮素、尿酸及胱抑素水平高于對照組，輕度DN和中重度DN高于單純糖尿病，中重度DN高于輕度DN，差異有統計學意義(P<0.05)；見表3。

圖1 miR-21和U6 熒光定量PCR的溶解曲線Fig.1 High resolution melting curve of fluorogenic quantitative PCR assay for miR-21 and U6Note: The dissolution curves of both miR-21 and U6 were single peaks,indicating good specificity of samples and high purity.The peak temperature of miR-21 was 73.5℃,U6 was 75℃.

GroupsnPeripheral miR-21 expressionControls600.852±0.203Diabetes600.905±0.337Mild DN441.005±0.3951)2)Moderate-severe DN411.435±0.5021)2)3)F-3.224P-0.025

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

GroupsnSerum creatinine(μmol/L)Urinary nitrogen(mmol/L)Uric acid(μmol/L)Cystatin(mg/L)Controls6063.5±11.44.8±0.6203.5±32.50.75±0.11Diabetes6077.6±13.51)7.2±1.21)275.4±44.61)1.03±0.261)Mild DN44102.3±16.51)2)11.4±1.91)2)372.5±53.21)2)1.42±0.331)2) Moderate-severe DN41146.8±17.21)2)3)14.8±1.71)2)3)543.5±56.81)2)3)1.77±0.431)2)3)F117.25088.245102.22433.441P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

GroupsnTGF-β(μg/L)HA(μg/L)CⅣ(μg/L)PCⅢ(μg/L)Controls606.85±0.8531.5±4.4844.2±5.5223.5±3.26Diabetes608.33±0.961)42.5±4.521)55.6±6.851)32.7±4.221)Mild DN4411.24±1.151)2)56.5±5.691)2)63.5±6.681)2)48.6±5.211)2) Moderate-severe DN4113.74±1.091)2)3)77.6±6.331)2)3)88.4±7.581)2)3)52.3±6.351)2)3)F88.526185.24176.25166.335P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

表5 各類受試者miR-21 mRNA表達水平與血清學標志物Pearson檢驗結果

Tab.5 Pearson test results of relationship between miR-21 mRNA expression and serologic markers

2.3各組受試者纖維化標志物測定結果 單純糖尿病、輕度DN和中重度DN的TGF-β、HA、CⅣ及PCⅢ水平高于對照組，輕度DN和中重度DN高于單純糖尿病，中重度DN高于輕度DN，差異有統計學意義(P<0.05)；見表4。

2.4相關性考察 Pearson檢驗結果顯示，糖尿病腎病患者外周血miR-21 mRNA表達水平與血肌酐、尿氮素、胱抑素、TGF-β、CⅣ、PCⅢ均呈直線正相關性(r依次=0.625、0.584、0.617、0.714、0.557、0.735，P<0.05)，單純糖尿病患者和對照組miR-21 mRNA表達與血清學標志物之間無明顯相關性(P>0.05)，見表5。進一步采用ROC曲線分析miR-21 mRNA表達水平對DN和中重度DN的預測價值，結果顯示miR-21 mRNA表達對DN和中重度DN均有預測價值(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 外周血miR-21 mRNA表達水平預測DN和中重度DN的ROC曲線Fig.2 ROC Curve of peripheral miR-21 mRNA express-ion to predict DN and severe DNNote: A.Mainly results for DN,AUC=0.669,P=0.015,best operating point=1.045,sensitivity=0.750,specificity=0.553;B.Mainly results for severe DN,AUC=0.846,P=0.000,best operating point=1.255,sensitivity=0.889,specificity=0.750.

3 討論

作為標志物進行疾病診斷與病情評估，miRNA有三方面的優勢，一是miRNA在人體內分布廣泛，不僅存在于器官、骨骼和肌肉，在外周血、尿液和組織液也普遍存在，能夠實現無創取樣，取樣便捷；二是miRNA穩定性高，相較于其他容易被機體代謝的物質，不容易受到檢測時間的影響；三是熒光定量PCR的敏感度極高，能夠實現對痕量物質的高精度定量，即使是miRNA含量極微的血清樣本，也能實現miRNA定量。miR-21是miRNA家族的重要成員之一，人miR-21基因定位于17q23.2，最初被認為是一種癌基因，在卵巢癌、結直腸癌、胃癌等多種癌癥中均呈高表達，能夠通過多種途徑提高腫瘤的侵襲性[7-9]。在腎細胞癌中，目前的多數研究結論支持miR-21高表達可促進腎細胞癌的發生與發展[10]，是臨床預后不良的獨立危險因素[11]。但在糖尿病腎病中，miR-21具體發揮何種作用還存在較大程度的爭議。

部分學者認為[12,13]，miR-21高表達是一種代償性反饋機制，可以拮抗TGF-β/smad信號通路引起的纖維化損傷及高糖引起的腎小球損傷，因此合理上調miR-21對糖尿病腎病起治療作用。也有學者指出[14，15]，miR-21參與了腎間質纖維化損傷的病理進程，且其促纖維化作用受到TGF-β的誘導，依賴于smad3，miR-21的高表達可降低靶基因人類第十號染色體缺失與磷酸酶和張力蛋白同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)的翻譯，從而激活下游蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體(mammalian rapamycin target protein complex，mTORC1)相關通路的表達，促進ECM形成和纖維結締組織增生。Wu等[16]也發現姜黃素衍生物C66即可通過抑制miR-21表達而緩解糖尿病腎病的腎間質損傷。本研究分析健康人群、單純糖尿病患者及不同發病程度的DN患者外周血miR-21變化趨勢，發現輕度DN和中重度DN的miR-21 mRNA表達水平高于對照組和單純糖尿病，中重度DN組的miR-21 mRNA表達水平高于輕度DN。該結果與臺灣學者Chien等[17]對50例糖尿病腎病臨床患者的調查結果基本一致，均支持第二種觀點。

DN的早期病理變化為腎小球和腎小管基底膜增厚和ECM逐漸堆積，在這個過程中，腎間質纖維化損傷已經開始；發展至DN晚期，纖維化損傷累及腎小管，腎單位受到嚴重破壞而出現大量蛋白尿、腎功能不全甚至腎衰竭[18]。為考察miR-21與腎間質損傷的關系，本研究進一步分析了miR-21 mRNA表達水平與患者腎功能和纖維化損傷標志物的相關性。在纖維化指標方面，研究選取了TGF-β、HA、CⅣ、PCⅢ 四項，其中TGF-β是miR-21介導纖維化損傷的重要協同因子，HA、CⅣ和PCⅢ是ECM的重要組成成分。結果證實糖尿病腎病患者外周血miR-21 mRNA表達水平與血肌酐、尿氮素、胱抑素、TGF-β、CⅣ、PCⅢ均呈直線正相關性，單純糖尿病患者和對照組miR-21 mRNA表達與腎功能損傷和腎間質纖維化的血清學標志物之間無明顯相關性，可能是由于單純糖尿病患者和對照組患者腎臟均無明顯損傷，這一結果進一步證實了miR-21在DN病理機制中介導了不可忽視的作用。另外，本研究還發現，在DN患者和單純性糖尿病患者中，miR-21還與糖尿病病程及HBA1c有關，與BS值無明顯相關性，這主要是因為糖尿病患者常年應用血糖控制藥物，入院時BS值較大程度上受到了藥物干預的影響，與DN疾病嚴重程度并不直接相關。而糖尿病腎病的腎損傷程度與糖尿病病程和HBA1c均呈正相關性，這一點已得到較多學者的證實[19,20]，兩者與miR-21均與腎損傷程度緊密關聯，故而也存在一定的相關性。進一步的數據分析結果顯示，miR-21 mRNA表達對DN和中重度DN均有預測價值，該結果證實外周血miR-21表達水平與腎間質損傷程度密切相關，能夠從一定程度上預測DN的發生與發展。

本研究尚有兩點不足之處，一是腎間質纖維化損傷的評估指標缺乏器官特異性，目前臨床上尚沒有針對腎纖維化損傷的專用指標，本研究所用的TGF-β、HA、CⅣ、PCⅢ為器官纖維化損傷的通用指標；二是miR-21在糖尿病腎病中的作用可能是一把雙刃劍，在不同的病理階段介導不同的作用，具有不同的變化趨勢，本研究未從各個病理階段進行平行考察，結果和結論可能存在一定的局限性。