黃芪多糖治療和預防性給藥對感染PR8小鼠的保護作用及機制研究①

盧春化 馬艷梅 王紅霞 薛 凌

(錦州醫科大學附屬第一醫院，錦州121000)

流感病毒感染所致的“細胞因子風暴”是高發病率和病死率的主要原因，機體感染后可產生一系列細胞因子，如TNF-α、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-1、MCP-1等[1-2]。炎癥介質失衡的同時產生過量的氧自由基，引起脂質過氧化，直接誘導組織損傷。MDA、GSH-Px及SOD水平是監測脂質過氧化的代表性指標。MDA是脂質過氧化作用的終產物，反映脂質過氧化程度[3]。而SOD、GSH及GSH-Px是維持機體氧化系統平衡的關鍵酶。當損傷性刺激破壞內膜氧化呼吸鏈，激發氧化應激時，產生的活性氧、脂類、氧化蛋白質等激活Caspase-3、Caspase-8，誘導細胞凋亡[4]。

近來研究發現黃芪多糖具有抗癌、抗病毒、抗凋亡、抗氧化等多種生物活性[5]。本實驗通過構建小鼠流感肺損傷模型，應用黃芪多糖干預，探討其對PR8所致小鼠肺損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠40只，6周齡，雌性，體質量18～20 g，購自北京維通利華有限公司。

1.1.2主要試劑 黃芪多糖(C10H7ClN2O2S，分子量254.69)購自中國藥品生物制品檢定所；SOD、MDA、GSH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取及qPCR檢測試劑盒購自QIAGEN；Caspase-3、8、9及β-actin抗體購自Abcam。

1.2方法

1.2.1小鼠模型的建立及給藥 分為正常對照組、PR8模型組、黃芪多糖治療組、黃芪多糖預防組、利巴韋林對照組，每組8只。黃芪多糖預防組:于感染流感病毒PR8前7 d，給予黃芪多糖200 mg/(kg·d)，灌胃給藥，連續給藥7 d。之后用乙醚將各組小鼠麻醉，正常對照組滴鼻30 μl無菌PBS，其余各組滴鼻30 μl PR8稀釋液(滴度:103pfu/鼠)[6]。除預防組外，各組小鼠在PR8感染24 h 后灌胃，1次/d，連續4 d。正常對照組和PR8模型組:灌胃100 μl無菌PBS；黃芪多糖治療組灌胃100 μl 黃芪多糖(2 000 mg/kg),利巴韋林對照組灌胃利巴韋林(100 mg/kg)。

1.2.2標本采集 PR8感染后第5天進行眼球采血，加入含EDTA-Na2的采血管中，3 000 r/min離心10 min，吸上清于EP管，-20℃保存。打開胸腔無菌取肺。

1.2.3小鼠肺指數和肺指數抑制率 肺組織用無菌PBS洗凈、吸干，稱重。肺指數=(肺重/體質量)×100%，肺指數抑制率=(模型組平均肺指數-實驗組平均肺指數)/模型組平均肺指數×100%。

1.2.4肺組織HE染色 肺左葉用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。

1.2.5SOD、GSH-Px、MDA水平 檢測血清和肺組織中MDA、SOD、GSH-Px水平，按試劑說明書進行。

1.2.6qPCR檢測TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β mRNA水平 用QIAGEN組織勻漿器將小鼠肺組織勻漿，提取總RNA。引物由TaKaRa公司合成，見表1。反應條件95℃ 5 min；95℃ 25 s，60℃ 25 s，72℃ 30 s 40 個循環。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。

1.2.7Western blot檢測凋亡蛋白表達 肺組織剪碎，液氮研磨，將研好組織轉至1.5 ml EP管中，加入800 μl Lysis buffer與PMSF的混合液，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，吸上清液至EP管中，進行BSA定量。100℃ 10 min變性，進行SDS-PAGE。加樣10 μl，電壓調至80 V，電泳約20 min，調電壓至110 V，待所檢測條帶跑至適合的位置停止電泳。120 mA恒流120 min轉膜，5%BSA室溫封閉1 h。加1∶1 000 Caspase-3/1∶1 000 Caspase-8/1∶1 000 Caspase-9/1∶5 000 actin一抗稀釋液后，自封袋壓膜，4℃搖床過夜。加1∶5 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發光，8 bit存圖。Scion Image 4.03軟件分析。

1.3統計學分析 用SPSS17.0進行統計分析，運用單因素方差分析、兩兩比較法(LSD法)分析結果。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1黃芪多糖對肺指數和肺指數抑制率的影響 PR8模型組與正常對照組肺指數比較，差異有統計學意義(P<0.01)；黃芪多糖治療組、預防組、利巴韋林對照組與PR8模型組比較差異有統計學意義(P<0.01；P<0.05；P<0.01)，見表2。

2.2HE染色 PR8模型組肺組織出現彌漫性肺水腫及出血，肺組織實變及炎性細胞浸潤，部分肺泡間隔破損斷裂。黃芪多糖治療組和利巴韋林對照組較PR8模型組病變減輕，形態較完整，有少量炎性細胞滲出。黃芪多糖預防組肺泡壁呈輕度增厚，伴肺泡損傷出血，有中度炎性細胞滲出，見圖1。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

Primer nameDirectionSequenceTNF-αF5′-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3′R5′-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3′IFN-αF5′-GTCACTACGAATCGCACCTGATCAC-3′R5′-CCGATGTATAGACATTCCTCTGG-3′IL-6F5′-TGATGCACTTGCAGAAAACAA-3′R5′-GGTCTTGGTCCTTAGCCACTC-3′IL-1βF5′-AAGGAGAACCAAGCACGACAAAA-3′R5′-TGGGGAACTCTGCAGACTCAAACT-3′GAPDHF5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′R5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′

GroupsLung indexInhibition rate(%)Normal control group0.73±0.07-PR8 group1.42±0.111)-Post-APS group0.98±0.133)30.99Pre-APS group1.25±0.142)11.97Ribavirin control group0.85±0.093)40.14

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

2.3血清及肺組織中MDA、GSH-Px、SOD水平 PR8模型組與正常對照組相比，MDA顯著升高(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性顯著降低(P<0.01)；與PR8模型組比較，黃芪多糖治療組和利巴韋林對照組MDA含量顯著降低(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性顯著升高(P<0.01)；與PR8模型組比較，黃芪多糖預防組MDA水平在一定程度上降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性呈上升趨勢 (P<0.05)。見表3、4 。

圖1 肺組織病理變化(A～E，×100；F～H，×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissue(A-E，×100；F-H，×400)Note: A.Normal control group;B.PR8 group;C.Astragalus polysaccharide treatment group;D.Astragalus polysaccharide prevention group;E.Ribavirin control group;F.Infiltration of inflammatory cell (PR8 group);G.Diffuse hyperplasia of the surrounding tissues of the trachea (PR8 group);H.Inflammatory exudate of the trachea (PR8 group).

GroupsMDA(nmol/ml)GSH-Px(U/ml)SOD(U/ml)Normal control group5.54±0.76312.54±16.11 438.74±10.65 PR8 group26.37±3.241)75.07±4.371)274.23±6.231)Post-APS group11.49±1.073)223.38±14.083)388.34±8.543)Pre-APS group23.90±0.792)98.14±5.642)294.45±7.062)Ribavirin control group8.16±1.133)278.80±13.043)403.34±9.853)

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsMDA(nmol/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)SOD(U/mg prot)Normal control group0.87±0.0834.50±1.4042.07±2.03PR8 group3.88±0.111)19.08±0.561)26.86±1.691)Post-APS group1.95±0.143)25.43±1.073)34.86±2.323)Pre-APS group3.27±0.162)21.72±1.382)29.53±2.172)Ribavirin control group1.36±0.073)29.98±1.233)35.87±2.013)

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

2.4TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α mRNA表達水平 PR8模型組肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α mRNA表達量較正常對照組明顯減少(P<0.01)，黃芪多糖治療組、預防組和利巴韋林對照組TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α 表達與PR8模型組比較顯著降低(P<0.01)。見圖2 。

2.5凋亡相關蛋白表達情況 PR8模型組肺組織中Caspase-3、8、9蛋白表達量較正常對照組明顯增加(P<0.01)；黃芪多糖治療組、預防組和利巴韋林對照組Caspase-3、8、9蛋白表達量較PR8模型組明顯減少(P<0.01)。見圖3、4。

圖2 肺組織TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-α mRNA相對表達量Fig.2 Relative expression levels of TNF-α,IL-6,IL-1 and IFN-α mRNA of lung tissueNote: Compared to normal control group,▲.P<0.01;compared to PR8 group,△.P<0.01.

圖3 肺組織凋亡相關蛋白Caspase-3、8、9的表達Fig.3 Expression of apoptosis-associated protein Caspase-3,8,and 9 in lung tissueNote: 1.Normal control group;2.PR8 group;3.Astragalus polysaccharide treatment group;4.Astragalus polysaccharide prevention group;5.Ribavirin control group.

圖4 肺組織凋亡相關蛋白Caspase-3、8、9的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3,8,and 9 of lung tissueNote: Compared to normal contrl group,▲.P<0.01;compared to PR8 group,△.P<0.01.

3 討論

流感病毒所致機體急性肺損傷主要機制“細胞因子風暴”，流感病毒感染機體后通過級聯放大效應，誘導細胞因子如TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β的大量產生。炎癥介質失衡誘發脂質過氧化，最終導致組織損傷。抗氧化物谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等所維持的氧化還原平衡失調，導致外源性或內源性氧化物堆積，激發機體氧化應激反應。大量研究結果表明，氧化損傷是病毒誘發細胞損傷或凋亡的主要途徑，通過啟動JNK對轉錄因子磷酸化修飾并調節下游靶基因轉錄，激活Caspase蛋白家族，誘導細胞凋亡[7]。

實踐證明，黃芪多糖是中醫治療肺熱咳嗽，高熱煩渴的有效藥物，具有免疫調節、抗氧化和抗炎以及抗癌等多種功效[8]。Abdullahi等[9]報道黃芪多糖和人參多糖能提高血清IgG抗體水平和細胞因子(IL-2、IL-10和IFN-γ)表達，具備改善免疫應答的潛力，可用作H5N1疫苗制劑的佐劑。本實驗結果顯示，黃芪多糖治療和預防性給藥均顯著改善PR8小鼠肺病理損傷，對小鼠急性肺損傷發揮保護作用，可見，黃芪多糖不僅可應用于治療流感感染，還可作為流感的預防性用藥。而黃芪多糖是否可以用于甲型H1N1疫苗的佐劑以提高疫苗的預防效果仍需要進一步的研究。本研究發現，黃芪多糖治療和預防給藥降低細胞因子TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β表達，緩解因炎癥介質失衡而引起的脂質過氧化，并能顯著上調抗氧化物GSH-Px、SOD活性以改善機體的氧化還原狀態，提高機體的抗氧化水平。Zhang等[10]實驗表明黃芪多糖下調炎癥相關因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA水平，抑制禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)在雞胚腎細胞中復制。Xue等[11]研究發現黃芪多糖降低氧化應激反應以抑制豬圓環病毒2型(PCV2)復制，降低細胞中MDA水平，提高GSH-Px和SOD活性。由此可見，炎癥反應、氧化應激與病毒感染緊密相關，黃芪多糖能下調流感病毒引發的過度炎癥損傷和氧化應激水平。

PR8組凋亡相關蛋白Caspase-3、8、9顯著上升，提示PR8通過誘導細胞凋亡引發肺損傷。應用黃芪多糖干預后，機體通過下調Caspase-3、8、9表達，發揮對肺組織的保護作用。由此可見，黃芪多糖在緩解流感急性肺損傷進程中具有積極作用。Xie等[12]在對黃芪多糖干預人心臟微血管內皮細胞(HCMEC)缺氧/復氧(HR)損傷機制時發現，黃芪多糖通過降低ROS、MDA和Bax水平，抑制Caspase-3的活性，提高NO、SOD、Bcl-2、PI3K水平，以保護HCMEC免受缺氧/復氧損傷。Liu等[13]研究發現黃芪多糖下調Caspase-3、Bax及上調Bcl-2蛋白水平，減少細胞內活性氧水平，逆轉心肌缺血再灌注誘導的細胞凋亡。結合MDA、GSH-Px、SOD指標，分析可見PR8所致的脂質超氧化產物堆積及細胞抗氧化水平降低，這兩方面共同促進細胞凋亡，而黃芪多糖通過提高胞內過氧化物分解酶活性，緩解脂質過氧化進程，提高機體抗氧化水平，緩解細胞凋亡進程。最新研究顯示，細胞凋亡在甲型流感病毒感染的早期階段增加，在感染的晚期細胞焦亡占主體。提示在H1N1感染的早期階段病毒誘導機體發生細胞凋亡，但細胞死亡途徑在感染的晚期向細胞焦亡轉變[14]。下一步本課題組將研究黃芪多糖對PR8感染小鼠晚期細胞焦亡的影響，以期探索H1N1感染過程中細胞焦亡的發生及黃芪多糖的免疫調節機制。

綜上所述，黃芪多糖通過下調炎性細胞因子的表達，有效減少PR8所致急性肺損傷氧自由基的產生，提高對氧自由基的清除力，下調凋亡相關蛋白Caspase-3、8、9的表達，從而發揮抗細胞凋亡及保護肺組織的作用，為臨床應用中藥黃芪多糖治療流感提供依據，為中醫藥治療流感提供新思路。