臭牡丹提取物體外抑菌及免疫毒理學研究①

張蜀艷 蒲建萍 李 政 張良璽

(成都工業職業技術學院，成都610051)

臭牡丹(Clerodendrum bungei steud，CBS)為雙子葉馬鞭草科大青屬植物,以根及葉入藥。夏季采葉，秋季采根,鮮用或曬干備用。性平，味甘、苦。歸經入肝、脾經。具有解痙、鎮痛、鎮靜、抗驚厥、抗炎、抗潰瘍、抗菌及解熱的作用，著名的云南蛇藥中即含有很大比例的“臭牡丹”。

CBS始載于《神農本草經》，在民間具有廣泛的使用記載，在《本經》《別錄》《藥性論》《日華子本草》《開寶本草》《滇南本草》中記載了具有行瘀、止痛、涼血、消腫的作用；在《植物名實圖考》《草木便方》《分類草藥性》《天寶本草》《貴州民間方藥集》《四川中藥志》《陜西中草藥》載有行氣健脾、祛風平肝、消腫解毒的功效；在《滇南本草》《中藥形性經驗鑒別法》《云南中草藥選》記載了具有祛風、截瘧、行氣、利水的作用；在《新疆中草藥手冊》《陜西中草藥》《陜甘寧青中草藥選》具有宣肺氣、祛風濕、消腫毒的作用；在《別錄》《日華子本草》《長沙藥解》《分類草藥性》《貴州民間方藥集》《四川中藥志》《上海常用中草藥》載有祛風除濕、活血散瘀的作用；在《千金方》《梅師集驗方》《四川中藥志》《云南中草藥選》《泉州本草》《江西民間草藥》《浙江民間草藥》《嶺南采藥錄》《南寧市藥物志》《廣東中藥》《廣西中草藥》載有消腫解毒、祛風止癢、治療黃疸的作用。

民間用法中發現CBS具有一定的抗菌性和提高人體免疫功能的功效,為了科學證明此結論,分別對CBS提取物做了體外抑菌實驗和免疫毒理學實驗,實驗如下。

1 材料與方法

1.1材料 致病大腸桿菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、酵母菌[CMCC(B)98007]、傷寒桿菌[CMCC(B)50071]、副傷寒甲桿菌[CMCC(B)50093]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]均由四川省藥品檢驗所提供。真菌培養基、營養肉湯固體培養基、瓊脂培養基均由四川省藥品檢驗所提供。高速組織勻漿機、燒杯、培養皿、培養箱、吸量管等為成都工業職業技術學院生化實訓室提供。地塞米松(Dexamethasone，DXMS)(江蘇恒瑞醫藥)，5%雞紅細胞(Chicken erythrocyte,CRBC)、邁格染料、甲醇、吉氏染粉、甘油、磷酸緩沖液(廈門海標科技有限公司)，生理鹽水(江西省創欣藥業集團有限公司)，丙酮-甲醇液、EDTA-Na2、CD3+-FITC Hamster anti-mouse、CD4+-PErat anti-mouse、CD8+-PerCP Rat anti-mouse(美國BD公司)。健康小白鼠90只，體重(20±2)g，清潔級雌雄各半(成都通德藥業有限公司實驗動物中心提供)。云芝多糖(Coriolus versicolor polysaccharide,CVP,西安艾諾醫藥科技有限責任公司)。二氧化碳培養箱(上海三騰儀器有限公司)；流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特)；高速離心機(廣州吉迪儀器有限公司)；倒置高倍顯微鏡(賽默飛世爾科技有限公司)；超靜無菌工作臺(山東博科科學儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1CBS提取物制備 樣品1：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈，絞碎取汁，混勻后超真空蒸餾，滅菌處理。樣品2：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈絞碎，用95%乙醇浸提，回收乙醇后真空蒸餾，滅菌處理。樣品3：新鮮CBS全株(葉、莖、根)洗凈，用100℃水、分3次煎煮后，乙醇沉淀，超真空蒸餾得凍干品，滅菌處理。CBS提取物:樣品3經過Sevage法除蛋白和透析得到分子量在8 kD以上的物質(本實驗室自制)。

1.2.2制備細菌液[1-3]本實驗在超凈工作臺中進行。分別從致病大腸桿菌、酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌的菌種斜面沾取少量菌苔接種到營養肉湯中，(36±1)℃培養箱中培養24 h后，作為原菌液；白色念珠菌真菌瓊脂斜面培養物挑取少量菌苔接種到真菌培養基中于20～25℃培養24 h后作為原菌液。分別用滅菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，使每1 ml中活菌數約1 000個，作為實驗菌液。

1.2.3制備供試液及實驗過程[4-6]CBS提取物用營養肉湯(白色念珠菌用真菌培養基)以對倍稀釋法對致病大腸桿菌、酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌供試液進行打碎攪勻逐管稀釋，使供試液濃度在每管中呈對倍遞減。制成每組濃度依次為500、250、125、62.5、31.2、15.6 mg/ml的供試液若干組。于每組供試液的抑菌實驗管中,分別加入相應已稀釋好的實驗菌液0.1 ml。以無菌水作空白對照，同時將陰性標準菌株加入樣品中，和樣品一起培養，作為陰性對照。然后置(36±1)℃培養24 h取出后,對各實驗管樣本劃線于營養瓊脂平板上，再置37℃培養24 h(白色念球菌置20～25℃后劃線于真菌瓊脂培養基上，再置20～25℃培養24 h)，觀察有無菌落生長。陰性對照不長菌，空白對照長菌則實驗方法成立。

1.2.4小鼠分組及處理[7-9]小鼠按表1進行分組，按表1劑量腹腔注射生理鹽水(或CVP陽性組或CBS)連續7 d后,注射DXMS連續7 d。

1.2.5巨噬細胞功能和免疫器官指數檢測 小鼠稱重，腹注CRBC，8 h后處死，腹注PBS，輕揉腹部，取腹腔液體0.5 ml，載玻片(37℃孵育30 min)，固定 5 min(丙酮∶甲醇=1∶1)，吉姆薩染色。每張涂片計數200 個巨噬細胞，按公式計算吞噬率和吞噬指數：吞噬率%=(吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/200個巨噬細胞數)×100%；吞噬指數=(被吞噬雞紅細胞總數/200個巨噬細胞數)/2；另取各組小鼠脾和胸腺稱重，按以下公式計算:脾臟指數=脾臟重量(mg)/體重(g)，胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)。

1.2.6外周血淋巴細胞亞群檢測 小鼠腹腔注射生理鹽水(或CVP或CBS)連續7 d，腹腔注射DXMS連續7 d，取眼球血0.5 ml，加入4%EDTA-Na2，取100 μl分別加CD3+、CD4+、CD8+抗體各5 μl，4℃避光30 min，各管加溶血素1 ml，避光10 min，PBS 1 ml，離心5 min(1 000 r/min)，將沉淀用 2 ml PBS洗滌,棄上清液,將沉淀用500 μl PBS重懸后上流式細胞儀分析。

1.3統計學分析 數據統計分析采用SPSS Statistics軟件，方差分析組間差異，變量在各組的均值與總均值之偏差平方和的總和，記作SSb，組間自由度dfb，再進行組間比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1CBS提取物外用抑菌情況 表2表明，CBS的水和乙醇提取物對酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和金黃色葡萄球菌抑制性強，對致病大腸桿菌和白色念球菌抑制性也較強，并且濃度越大抑制性越強，其中水提物的抑菌性優于乙醇提取物，再次證實了傳統用藥方法的合理性。當CBS水提物在125 g/L時，對所有實驗用細菌均有理想的抑制作用，其中在外觀上樣品3具有明顯的優勢，所以在CBS免疫毒理學實驗中均采用樣品3作為供試品。

表1 實驗用小鼠分組及腹腔注射劑量

Tab.1 Grouping and intraperitoneal injection dose of experimental mice

Groups(n=15)Control(ml)DXMS(ml)DXMS+CVP(ml)DXMS+CBSHigh dose(ml)DXMS+CBSMiddle dose(ml)DXMS+CBSLow dose(ml)Normal saline0.20.20.00.00.00.0CVP(20 g/L)0.00.00.20.00.00.0CBS(20 g/L)0.00.00.00.20.00.0CBS(10 g/L)0.00.00.00.00.20.0CBS(5 g/L)0.00.00.00.00.00.2DXMS(mg/kg)0.0100100100100100

表2 臭牡丹提取物外用抑菌實驗結果

Tab.2 Experimental results of external application of extract from CBS

ConcentrationPathogenic Escherichia coliYeastSalmonella typhiParatyphoid BacillusStaphylococcus aureusCandida abicans500(mg/ml)Sample 1------Sample 2- -----Sample 3- -----250(mg/ml)Sample 1- -----Sample 2- -----Sample 3- -----125(mg/ml)Sample 1- -----Sample 2- ----+Sample 3- -----62.5(mg/ml)Sample 1- ---- +Sample 2 + ---- +Sample 3- ---- +31.2(mg/ml)Sample 1 + ---- +Sample 2 + + + ++ +Sample 3 + ---- +15.6(mg/ml)Sample 1 + + + ++ +Sample 2 + + + ++ +Sample 3 + + + ++ +

Note：+.Growth of bacteria;-.No growth of bacteria.

GroupsPhagocytosis rate(%)Phagocytosis indexSpleen indexThymus indexControl36.5±3.71 0.265±0.025.65±0.643.67±0.54DXMS19.90±3.341)0.157±0.021)2.08±0.241)0.92±0.281)DXMS+CVP23.98±2.602)0.179±0.032)3.74±0.363)1.47±0.323)DXMS+CBS(20 g/L)28.78±4.304)0.245±0.025)4.35±0.655)1.84±0.435)DXMS+CBS(10 g/L)23.77±4.560.199±0.04 3.92±0.521.53±0.202)DXMS+CBS(5 g/L)21.17±4.67 0.185±0.023.33±0.531.44±0.28

Note：1)P<0.01 vs control;2)P< 0.05，3)P<0.01 vs DXMS;4)P<0.05，5)P<0.01 vs DXMS+CVP.

GroupsCD3+T(%)CD4+T(%)CD8+T(%)CD4+CD8+Control76.05±4.91 39.51±3.8135.65±3.541.11±0.19DXMS93.19±4.741)77.03±6.211)19.78±1.431)3.89±0.791)DXMS+CVP96.10±4.2376.65±6.16 20.24±1.953.79±0.67DXMS+CBS(20 g/L)99.74±2.273)72.99±5.2331.81±4.943)5)2.29±0.593)5)DXMS+CBS(10 g/L)98.70±1.963)78.59±6.2722.25±1.384)3.53±0.532)DXMS+CBS(5 g/L)96.08±4.1679.43±3.5321.50±2.193.69±0.82

Note：1)P<0.01 vs control;2)P< 0.05，3)P<0.01 vs DXMS;4)P<0.05，5)P<0.01 vs DXMS+CVP.

2.2CBS對免疫抑制模型腹腔巨噬細胞功能和免疫器官指數的影響 相比于陽性組，高劑量CBS能使免疫抑制小鼠的吞噬率、吞噬指數明顯提高(P<0.05或P<0.01)。相比于模型組，陽性組的CVP與中、高劑量的CBS提取物均能明顯提高吞噬率和吞噬指數(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組的各項指標均明顯降低(P<0.01)，其中巨噬細胞吞噬率下降45.5%，吞噬指數下降40.8%，脾臟和胸腺指數則分別下降63.2% 和74.9%。模型組脾臟及胸腺指數均小于空白組(P<0.01)。CVP與各劑量CBS均能提高免疫抑制小鼠的胸腺指數和脾臟指數 (P<0.01或P<0.05)；陽性組與高劑量CBS 組相比差異有顯著性統計學意義(P<0.01)，見表3。

2.3CBS對免疫抑制小鼠T淋巴細胞亞群的影響 與空白組比較，DXMS、CVP、CBS均能明顯升高CD3+T(P<0.01)、CD4+T(P<0.01)淋巴細胞的陽性率和CD4+/CD8+T細胞數量比值，降低CD8+T淋巴細胞的百分率(P<0.01),并隨著CBS濃度增大，CD3+T、CD8+T淋巴細胞數量均有增大的趨勢，而CD4+T淋巴細胞數量則減少。

與陽性組比較，高濃度CBS能較明顯提高CD3+CD8+T淋巴細胞數量的陽性率,降低CD4+T淋巴細胞數量陽性率和CD4+/CD8+的比值,中、低濃度對CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞數量陽性率和CD4+/CD8+的比值改變不大,見表4。

3 討論

CBS水提物對酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、致病大腸桿菌、白色念球菌6種細菌抑制性優于乙醇提取物，且外觀性較好，CBS水提物濃度大于等于125 g/L時，對實驗用細菌均有理想抑制作用。溶劑便宜易得，有較高的開發和利用價值，在以后的研究中對實驗條件可深入研究，增加提取率。

小鼠免疫抑制模型用地塞米松來制作。本研究通過連續7 d對小鼠腹腔注射100 mg/kg地塞米松造模，出現食少納呆、疲乏無力等表現，免疫器官萎縮明顯，腹腔吞噬指數和巨噬細胞吞噬率降低明顯，表明小鼠免疫功能明顯下降[10]。

巨噬細胞屬免疫細胞，主要是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬作用，激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作出反應。研究表明，CBS與CVP相比能明顯提高免疫抑制小鼠對CRBC的吞噬率與吞噬指數，對非特異免疫功能有明顯促進作用[11]。

脾臟是機體最大的免疫器官，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，有大量的巨噬細胞和淋巴細胞；胸腺為機體的重要免疫器官，是T淋巴細胞成熟分化的重要場所，與免疫緊密相關。DXMS使小鼠的免疫器官重量降低、脾淋巴細胞總數顯著增加，CBS 能明顯拮抗DXMS的細胞毒作用，促進淋巴細胞增殖，提高免疫抑制小鼠的免疫器官指數及重量，有明顯的保護作用[12,13]。

T淋巴細胞亞群的測定是檢測機體細胞免疫功能的重要指標，T淋巴細胞(CD3+)主要由輔助性T細胞(CD4+)和細胞毒性T細胞(CD8+)組成，CD4+T細胞具有協助體液免疫和細胞免疫的功能，去除受感染細胞，CD8+T細胞分布在抑制性T淋巴細胞和殺傷性T淋巴細胞表面,在免疫系統中發揮重要作用。注射DXMS的小鼠淋巴細胞總數降低、CD3+T細胞數量升高，提示DXMS可能對淋巴細胞及單核細胞具有更明顯的細胞毒作用；注射CBS和CVP的小鼠淋巴細胞總數升高的同時CD3+和CD8+T細胞數量明顯升高,提示CBS在促進T細胞增殖的同時對B淋巴細胞及單核細胞具有增殖作用；此外，評價機體免疫平衡的重要指標CD4+/CD8+T細胞數量比值一般在1～2之間，高劑量CBS能通過升高CD8+T細胞數量的同時降低CD4+T細胞數量，使免疫抑制小鼠CD4+/CD8+T細胞數量明顯降低并接近正常值，表明了CBS可改善DXMS引起的機體細胞免疫功能紊亂，且效果優于CVP。

以上結果提示，CBS 能對DXMS引起的免疫低下小鼠細胞免疫功能有促進作用，通過重建和維系免疫功能，有望開發成新的恢復和改善免疫功能的有效調節劑，針對艾滋病、紅斑狼瘡等免疫系統破壞的疑難疾病，本藥品可以通過重建和維持免疫功能，開發出有針對性獲得恢復或改善免疫功能的有效藥物，其作用機理有待進一步研究[14-16]。

CBS具有抑菌性和免疫調節功能，這兩大功能與免疫性疾病產生機理對比分析，我們推測CBS可以用來對抗免疫性病毒，一方面它能夠殺滅因病毒入侵人體而感染的各種病菌，同時它又能夠重建和維持人體的免疫功能。進一步的研究如能大量獲取CBS的有效成分，開發出有針對性獲得恢復或改善免疫功能的有效藥物，在人類對抗免疫性病毒的進程中將會提供有益的補充。