CD4+CD25+Treg細胞在小鼠Lewis肺癌生長及轉移中的作用①

周奕辰 王金巖

(中國醫科大學基礎醫學院免疫教研室，沈陽110122)

肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，肺癌的轉移是導致患者死亡的主要原因。肺癌的發生發展是一個復雜過程，涉及原位癌的形成、演化以及遠隔組織的侵襲與轉移，其中腫瘤原位癌的形成和演化特性決定腫瘤的侵襲與轉移[1]。肺癌的發生發展與機體的免疫系統密切相關。免疫系統和腫瘤細胞相互作用影響腫瘤的形成和演化，如免疫原性較強的腫瘤細胞可被免疫系統識別并清除，而免疫原性較弱的腫瘤細胞得以存活并與基質細胞和免疫細胞共同構成腫瘤微環境，有助于腫瘤細胞的存活和演化[2]。研究發現，腫瘤微環境中免疫細胞的種類和數量在肺癌的發生發展過程中發揮重要作用，如腫瘤浸潤性CD8+T細胞和NK細胞的數量與腫瘤患者的臨床預后正相關，而浸潤性免疫抑制細胞如MDSC和Treg細胞的數量則與腫瘤的預后負相關[3]。

CD4+CD25+regulatory T細胞是調節性CD4+T細胞亞群，在維持機體自身耐受和調控免疫應答水平中起重要作用[4]。研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞通過抑制抗腫瘤免疫應答廣泛參與腫瘤的發生發展，如CD4+CD25+Treg細胞表達多種抑制性受體如CTLA-4和LAG-3等分子直接抑制腫瘤特異性T細胞的活化和效應功能。另外，CD4+CD25+Treg細胞可產生多種抑制性細胞因子如IL-10和TGF-β等間接抑制抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤的進展。抑制CD4+CD25+Treg細胞活化及功能或清除CD4+CD25+Treg細胞則促進抗腫瘤免疫應答，抑制多種腫瘤的進展[5]。這些研究提示CD4+CD25+Treg細胞通過促進腫瘤免疫逃逸加速腫瘤的發生發展[6]。然而，也有些研究顯示，腫瘤組織中CD4+CD25+Treg細胞可再編程分化成效應性T細胞，增強抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤的進展[7,8]，所以，CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤發生發展中的作用尚不明確[7]。

本研究利用Lewis肺癌的皮下移植腫瘤模型，采用流式細胞儀技術、過繼免疫細胞回輸和HE組織化學染色等技術探討了CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤生長與遠處組織轉移的作用。研究結果顯示，荷瘤鼠脾臟CD4+CD25+Treg細胞的百分率和細胞數量明顯增加；過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞顯著促進原位腫瘤的生長以及肺部轉移。體外研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞以非直接作用于LLC腫瘤細胞方式促進其遷移。這些結果說明CD4+CD25+Treg細胞可通過以非直接作用于LLC腫瘤細胞方式在肺癌發生發展中發揮重要的促進作用。上述結果為肺癌的發病機制以及免疫防治提供新策略。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1細胞株及動物 Lewis肺癌細胞(Lewis lung carcinoma,LLC)購自中科院上海細胞庫，LLC在含有10%小牛血清的高糖DMEM細胞培養液中常規傳代培養。7～8周齡雌性C57BL/6鼠購自北京維通利華公司，飼養于本校動物部SPF級動物室，進食水自由。

1.1.2試劑 小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞磁珠分選試劑盒以及分選緩沖液購于美天旎生物技術有限公司(德國)；實驗用抗體，包括Percp-anti-mouse-CD4和 APC-anti-mouse-Foxp3購自Biolegend公司(美國)；固定透膜液和透膜洗液均購自ebioscience公司(美國)；高糖DMEM細胞培養液與小牛血清均購自Gibco公司(美國)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 皮下移植腫瘤鼠模型的建立：收集對數生長期LLC細胞，生理鹽水重懸制成細胞懸液，調整最終濃度為1×107個/ml。經小鼠右側肩胛部皮下接種LLC細胞，每只C57BL/6鼠接種腫瘤細胞數為1×106個/0.1 ml。

皮下接種腫瘤細胞后觀察腫瘤生長情況。至第 7 天左右荷瘤鼠皮下接種部位可觸及腫塊。待腫瘤體積可測量后，隔天用游標卡尺測量腫瘤的長徑a，短徑b并根據公式(腫瘤體積=1/2×a×b2)計算腫瘤體積。

1.2.2流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞 常規方法制備鼠脾臟單細胞懸液，用含2%胎牛血清的PBS調整細胞終濃度為1×107個/ml，每個流式管取0.1 ml細胞懸液。

為檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞，各流式管內加入單克隆抗體(Percp-anti-mouse-CD4)進行細胞表面染色，4℃避光孵育40 min，經緩沖液洗滌細胞后進行細胞破膜處理和細胞內Foxp3染色。各試驗管內加入Foxp3固定透膜劑，4℃孵育60 min。透膜洗液洗滌后加入APC-anti-mouse-Foxp3 mAb進行胞內染色。4℃孵育45 min，透膜洗液洗滌后加緩沖液上機檢測，每個樣本至少采集1×105個細胞。設置相應的同型對照管和單標管，同型對照管加等量相對應同型對照抗體，單標管加單一的熒光抗體。流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的百分比及數量。

1.2.3磁珠分選純化CD4+CD25+Treg細胞 無菌制備荷瘤鼠脾單細胞懸液，經紅細胞裂解、細胞濾網過濾及CD16/32單抗封閉細胞表面Fc段受體后，使用CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit進行細胞分選。細胞分選方法按照試劑盒說明書進行。簡言之，首先利用L型磁珠分選柱陰性選擇方法去除脾單細胞懸液中非CD4+T細胞，再利用M型磁珠分選柱陽性選擇CD25+T細胞，最后收集得到的細胞為CD4+CD25+Treg細胞，臺盼藍染色計數。

1.2.4過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞 取磁珠分選的CD4+CD25+Treg細胞，調整最終濃度為5×105個/ml。在實驗鼠接種LLC細胞當日，經尾靜脈過繼回輸上述細胞，每只鼠回輸5×104個細胞，以尾靜脈注射PBS為對照。

1.2.5建立CD4+CD25+Treg細胞和LLC細胞共培養體系及劃痕試驗 取對數生長期LLC細胞，調整最終濃度為1×106個/孔，接種到6孔板，細胞貼壁后，使用200 μl吸頭在培養板底部豎直劃線，PBS洗滌多余的細胞，加入1%FBS的1640培養基，然后加入1×106個磁珠分選的CD4+CD25+Treg細胞，以加入PBS為對照，37℃培養箱培養，24 h后倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6HE組織染色檢測肺部轉移性腫瘤結節 在建立小鼠轉移瘤模型的當日同時過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞，在第28天處死小鼠后，取出肺臟，多聚甲醛固定24 h，脫水入蠟，包埋后切片HE染色，拍照。

2 結果

2.1荷瘤小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數量增多 皮下接種LLC細胞，至腫瘤生長至第7天，處理荷瘤鼠。應用流式細胞儀檢測荷瘤鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的百分比和數量。正常對照鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞約占總淋巴細胞數的1.46%，荷瘤鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞約占總淋巴細胞數的3.28%。并且，與對照正常組小鼠相比，荷瘤鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的絕對數量顯著增加[(1.0±0.2)×106vs (2.8±0.75)×106，P<0.05]。這些結果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞參與荷瘤鼠的腫瘤形成。 見圖1。

圖1 荷瘤鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的百分比增加和數量增多Fig.1 Increased frequency and absolute number of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in total splenic lymphoyctes of LLC miceNote: **.P<0.01.

2.2過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞促進Lewis肺癌的進展 為了確認CD4+CD25+Treg細胞對Lewis肺癌發生發展的影響，我們在實驗鼠皮下接種LLC細胞的當日，過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞，觀察腫瘤的生長情況。如圖2顯示，PBS對照組荷瘤鼠和過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠的腫瘤形成時間沒有顯著性差異，兩組荷瘤鼠的腫瘤生長均隨時間延長逐漸增大。然而，腫瘤生長至第21和23天，過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠的腫瘤體積顯著大于PBS對照組荷瘤鼠。這個結果提示CD4+CD25+Treg細胞促進Lewis肺癌的生長。

2.3過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞縮短荷瘤小鼠存活時間 腫瘤形成后，腫瘤微環境中腫瘤細胞與免疫細胞相互作用，在免疫系統的選擇壓力下演化進而決定腫瘤的結局。為了進一步確定CD4+CD25+Treg細胞在Lewis肺癌演化中的作用，我們在過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞后指定時間記錄荷瘤鼠的生存情況。圖3顯示，與PBS對照組荷瘤鼠相比，過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠的生存期縮短，生存率顯著降低(P<0.05)。過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠在第21天的生存率為60%，至第26天荷瘤鼠的生存率僅為25%。這些結果提示CD4+CD25+Treg細胞在Lewis肺癌演化發展過程中發揮促進作用。

圖2 回輸CD4+CD25+Treg細胞促進LLC的生長Fig.2 Adoptive transfer of CD4+CD25+Treg cells promote LLC growth

圖3 過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞縮短荷瘤鼠的存活時間Fig.3 Adoptive transfer of CD4+CD25+Treg cells decrease survival of LLC mice

2.4CD4+CD25+Treg細胞顯著促進腫瘤的肺部侵襲與轉移 腫瘤原位癌的發生發展與腫瘤的侵襲與轉移密切相關。為了確認CD4+CD25+Treg細胞對Lewis肺癌侵襲與轉移的影響，我們在過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞后第28天處理荷瘤鼠，利用HE組織染色技術觀察肺部腫瘤結節形成情況。PBS對照組荷瘤鼠肺部偶見或未見轉移性腫瘤結節。相反，過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠的肺部可見數個轉移性腫瘤結節。與PBS對照組荷瘤鼠相比，過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞組荷瘤鼠的肺部轉移性腫瘤結節明顯增多[(1.8±0.8) vs (4.6±2.3)，P<0.05]，見圖4。

2.5CD4+CD25+Treg細胞非直接促進LLC遷移 為了闡明CD4+CD25+Treg細胞促進LLC轉移的相關機制，我們在體外建立CD4+CD25+Treg細胞與LLC細胞共培養體系，通過劃痕實驗判斷LLC細胞的遷移情況。結果顯示：與PBS對照組相比，LLC細胞與CD4+CD25+Treg細胞共培養24 h后LLC細胞的遷移距離無顯著差異。這個結果提示CD4+CD25+Treg細胞非直接促進LLC細胞遷移。見圖5。

圖4 過繼回輸CD4+CD25+Treg細胞促進荷瘤鼠的肺部轉移Fig.4 Adoptive transfer of CD4+CD25+Treg cells enhance lung metastasis of LLC mice

圖5 CD4+CD25+Treg細胞不直接改變LLC細胞的遷移Fig.5 CD4+CD25+ Treg cells unalter migration of LLC directly

3 討論

腫瘤的發生發展是一個多步驟的序貫復雜過程，涉及原發組織腫瘤微環境的形成、腫瘤演化以及遠隔組織的侵襲與轉移并形成腫瘤轉移小璽(Metastatic niche)。腫瘤細胞以及多種基質細胞和免疫細胞，特別是抑制性免疫細胞參與該過程[9]。

大量研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞抑制抗腫瘤免疫應答，促進免疫逃逸進而促進多種腫瘤的發生發展，包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等[10]。然而，也有研究發現，CD4+CD25+Treg細胞可在炎性微環境中具有表型和功能的可塑性，如CD4+CD25+Treg細胞可丟失其轉錄因子Foxp3及相關的抑制分子表達，進而細胞再編程分化為促炎效應細胞[8]。Sharma等[7]的研究表明，小鼠經含有抗原、IFA和CpG的疫苗免疫后，體內CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞可被去分化為Th1樣效應細胞，并表達CD40L分子促進抗原提呈細胞經抗原交叉呈遞途徑活化CD8 T細胞[7]。因此，闡明CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在腫瘤發生發展中的作用具有重要意義。本研究利用Lewis肺癌的皮下移植瘤模型觀察了CD4+CD25+Treg細胞在肺癌發生發展中的作用，結果顯示CD4+CD25+Treg細胞以非直接作用于LLC細胞方式促進Lewis肺癌的生長與轉移。

大量研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞具有免疫抑制作用，參與多種腫瘤的形成及進展，本研究結果顯示Lewis荷瘤鼠脾臟中CD4+CD25+Treg細胞的百分比和數量顯著增多。另外，我們的研究結果也顯示腫瘤組織含有一定數量的CD4+CD25+Treg細胞(結果未發表)。這些結果提示CD4+CD25+Treg細胞參與Lewis肺癌的發生發展。

在免疫系統的選擇性壓力下腫瘤細胞發生演化進而決定腫瘤的進展和結局[11]。 我們的研究結果顯示，回輸CD4+CD25+Treg細胞雖然沒有加速腫瘤的形成時間，卻顯著促進腫瘤的生長并縮短荷瘤鼠的生存時間，降低荷瘤鼠的存活率。這些結果說明CD4+CD25+Treg細胞可加速Lewis肺癌的進展。

腫瘤的侵襲與轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤的侵襲與轉移是一個復雜的連續過程，涉及原發腫瘤組織中重塑腫瘤微環境如血管新生、降解基質使腫瘤細胞脫離原發病灶；腫瘤細胞穿越局部毛細血管或淋巴管壁進入血液或淋巴循環；隨著血液或淋巴液運輸至靶器官毛細血管床，與該部位血管或淋巴管內皮細胞發生黏附，穿越管壁和基底膜進入周圍間質；在繼發組織部位存活并形成腫瘤轉移小璽[12]。研究顯示，免疫系統與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。特別是，CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤的侵襲與轉移中發揮重要作用[13]。本研究結果顯示，荷瘤鼠進展至4周后可在肺組織形成轉移性腫瘤結節，這個結果提示，腫瘤原發部位的LLC細胞可脫離原發腫瘤組織經血液循環穿過肺組織局部毛細血管內皮細胞進入肺組織；進入肺組織的LLC細胞存活并形成腫瘤轉移小璽，最終發展成肺部組織的轉移性腫瘤結節。回輸CD4+CD25+Treg細胞后荷瘤鼠肺組織轉移性腫瘤結節明顯增多，說明CD4+CD25+Treg細胞可促進原發腫瘤組織中腫瘤細胞向遠隔組織侵襲與轉移。

CD4+CD25+Treg細胞促進腫瘤侵襲與轉移的機制仍然不清[14]。我們的研究顯示CD4+CD25+Treg細胞并非直接作用于LLC細胞促進其遷移，提示其可通過間接方式促進LLC細胞的發生發展，如CD4+CD25+Treg細胞可作用于其他免疫細胞或非血源性基質細胞促進腫瘤細胞的侵襲與轉移。的確，我們的前期研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞可促進腫瘤相關巨噬細胞向M2型細胞極化，極化的M2型細胞可產生多種介質，包括MMP-9、VEGF、IL-10、Arg-1參與腫瘤的侵襲于轉移(數據未發表)。因此，我們推測CD4+CD25+Treg細胞可通過動員巨噬細胞的M2極化，促進腫瘤細胞的侵襲與轉移。另外，我們的研究也提示CD4+CD25+Treg細胞可通過產生腺苷促進腫瘤的侵襲與轉移，阻斷腺苷-腺苷受體信號通路顯著抑制腫瘤的進展，延長荷瘤小鼠的存活時間(數據未發表)。上述研究結果說明CD4+CD25+Treg細胞可通過多種機制加速腫瘤進展。本研究結果與李欣等的研究結果類似[15]。也有研究顯示，CD81分子在CD4+CD25+Treg細胞促進腫瘤侵襲與轉移過程中發揮關鍵作用。敲除CD81分子后Treg細胞的發育和分化受阻，限制腫瘤的侵襲與轉移[16]。

總之，本實驗利用Lewis肺癌的皮下移植腫瘤模型發現CD4+CD25+Treg細胞不但促進原位腫瘤組織的生長和演化，而且促進腫瘤細胞向遠隔組織部位侵襲與轉移。因此，我們推測CD4+CD25+Treg細胞在肺癌的發生發展過程中發揮重要的促進作用，靶向CD4+CD25+Treg細胞的免疫治療將有效延緩肺癌的進展。