人晶狀體上皮細胞BHMT基因過表達慢病毒載體的構建及鑒定*

周海燕,薛雨順,王新川,高寧寧

1.陜西省人民醫院眼科(西安 710068);2.空軍軍醫大學基礎醫學院(西安 710032)

大量的研究已證實蛋氨酸(Methionine,Met) 對維持晶狀體透明度是非常重要的，它是抗氧化物谷胱甘肽的前體[1-2]。甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶(Betaine-homocysteinemethy transferase，BHMT)是Met循環中重要的酶，它利用同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(Betaine，Bet)催化 Met 的再合成[3-4]。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT 是一個大量表達的基因[5]。前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標記的蛋白質組學技術研究分析了不同年齡人白內障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質,首次報道了BHMT在高齡組白內障晶狀體核區的水平較年輕組明顯下調，進一步通過新的臨床白內障晶狀體標本進行了驗證[6]。但其在晶狀體老化和白內障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。本研究將構建穩定過表達BHMT的慢病毒載體，并轉染人晶狀體上皮細胞，為進一步研究其在白內障發生發展中的作用提供生物學基礎。

材料與方法

1 主要試劑及儀器 人晶狀體上皮細胞(Human lens epithelial cells,HLEC)由本實驗室保存,慢病毒GV358載體、AgeI / AgeI 酶切，購自上海吉凱基因化學技術有限公司。1kp DNA ladder Marker(Fermentas公司),瓊脂糖(賽百盛公司),250 bp DNA ladder Marker與Primer(捷瑞生物公司)。In-FusionTMPCR Cloning Kit (Clontech公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化,Taq polymerase(SinoBio公司),限制性內切酶(NEB公司)。dNTP(Takara公司), PCR儀(Applied Biosystems), DMEM培養基(含10% 胎牛血清)購自 Gibco 公司，引物由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

2 細胞培養 HLEC培養于含體積分數15% 胎牛血清的低糖 DMEM 7培養液中，置于37 ℃、體積分數為5%CO2的恒溫孵箱內培養。

3 研究方法

3.1 引物設計和合成：從Gen Bank 資料庫中獲得人 BHMT 的 mRNA 序列(NM-001713),基因引物設計為：上游 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCCACCCGTTGGGGGCAAAAAG- 3′；下游：5′- TCCTTGTAGTCCATACCCTGTGATTTGAATTTTTGTTTTTC - 3′。聚合酶鏈反應擴增 BHMT 基因片段。

3.2 BHMT-GV358 過表達質粒載體構建：用 Age I 酶對純化的 GV358 質粒 DNA 進行酶切，對載體酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，獲得線性化的 GV358 載體。將RT-PCR擴增純化的BHMT基因片段與酶切后 GV358 質粒 DNA連接得到重組載體GHMT-GV358，行 PCR 鑒定，鑒定的陽性克隆轉化子測序,測序結果和目的基因序列比對分析。將正確的菌液轉接到10 ml 含相應抗生素的液體培養基中，37℃過夜培養，進行質粒抽提。

3.3 慢病毒包裝及滴度測定：將該慢病毒包裝系統中的3種質粒(BHMT-GV358 20 μg，pHelper 1.0載體 15 μg，pHelper 2.0 載體 10 μg)與轉染試劑混勻，室溫下孵育15 min，將復合物加入293T細胞培養液中孵育養，于37℃、5%CO2環境培養6～8 h, 棄去原培養基，換上10 %含 FBS 的 DMEM 10 ml，繼續培養48 h，收集含有病毒顆粒的細胞上清。將取得的病毒上清液于25 000 r/min，4 ℃條件下離心2 h，收集沉淀，加入適量病毒保存液，重懸，高速離心5 min 后，取上清，分裝并保存至-80 ℃冰箱。進行慢病毒滴度測定。

3.4 BHMT基因表達檢測：對數生長期的293T細胞接種到24孔板中(細胞數約為 2×104)，37℃、5% CO2環境培養細胞融合度達到約80%。使用Lipofectamine 2000轉染，4～6 h 后觀察細胞狀態，更換新鮮培養基。轉染24 h 后觀察質粒熒光標記基因表達情況，判斷轉染效率，熒光率大于80%，熒光拍完后補加500 μl正常培養基，待長滿后收集細胞用于RNA提取或蛋白質檢測。①RT- PCR檢測BHMT mRNA的表達。實驗分組：陰性對照組(NC組)、BHMT過表達組(OE組)用于擴增基因的引物序列上游：5'- CCACTTTGACCCCACCATTA- 3'，下游：5'- GCTAGCTCATTTGTCGTCATC- 3'；以 GAPDH 基因為內參照基因，用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。mRNA 相對表達量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-內參基因 Ct 值，-ΔΔCt=對照組 ΔCt 平均值-各樣品ΔCt 值。②Western blot 法檢測BHMT基因表達。各組細胞裂解后超聲破碎細胞，取上清 BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，經 SDS-PAGE分離后，電轉移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h之后于 4 ℃ 冰箱內與一抗孵育過夜，室溫漂洗后給予二抗孵育1 h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，用ECL法結合X光片顯色。

3.5 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞:人晶狀體上皮細胞分為兩組，感染組,(LV-BHMT24172-1)病毒感染，對照組,陰性對照病毒CON220感染，分別接種于 6 孔板，細胞密度為20%，感染條件為Eni.S+polybrene，以感染復數(MOI)= 10 計算病毒量，感染后 16 h更換感染液,72 h于熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，熒光率要達到70%～80%左右，細胞匯合度達80%左右后進入下一步實驗。

結 果

1 成功構建BHMT-GV358 載體 PCR 擴增目的基因并行凝膠電泳，見目的條帶出現于1262 bp 處(圖 1)。構建 BHMT-GV358 重組載體后，進行 PCR 鑒定，顯示在第5～12泳道出現目的條帶(圖 2)，陽性轉化子PCR產物大小為655 kb，進行測序及比對驗證，經 GenBank 中BHMT序列對比驗證，序列完全一致，表明已成功構建重組質粒(圖 3)。

2 轉染后細胞熒光觀察及滴度測定 將BHMT-GV358 病毒包裝后感染 293T細胞，熒光顯微鏡見熒光表達結果較強(圖4)。細胞內觀察到明顯熒光，說明目的質粒轉染正常，熒光標記基因表達正常，表示 BHMT蛋白可以在 293T細胞中表達。根據計算公式qPCR 滴度(TU/ml)=N×C/V，計算平均滴度。經滴度檢測，病毒滴度約為2.00E+08TU/ml。

3 RT-PCR 檢測 BHMT基因表達情況 見表1。將病毒濃縮液加入293T細胞培養基，獲得穩定感染的293T細胞。轉染后提取細胞內總 RNA，利用RT-PCR 法檢測BHMT mRNA 的表達水平，所得結果與GAPDH的結果相比較。在本實驗中過表達組BHMT基因表達豐度明顯升高，是對照組的986.181倍(圖5)，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 BHMT基因在各組的表達豐度

注：與過表達組與對照組相比, *P<0.05

圖1 BHMT基因片段的PCR擴增

1:陰性對照(ddH2O); 2:陰性對照(空載體);3:陽性對照(GAPDH);4:Marker：5、3、2 、1.5、1 kb，750、500、250、100 bp；5～12：轉化子

圖2 BHMT-GV358載體的酶切鑒定

圖3 克隆序列測序圖

圖4 BHMT-GV358載體轉染293T細胞(熒光視野與明視野對照圖)(100×, 200×)

圖5 轉染后各組 BHMT mRNA 相對表達量 (P<0.05)

4 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞 熒光顯微鏡下觀察病毒轉染后的過表達細胞系可見GFP表達，感染效率在90%左右(圖6)

圖6 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞

5 Western blot 方法檢測 BHMT蛋白表達情況 感染重組慢病毒BHMT 48 h 后收集重組慢病毒感染和對照未感染的293T細胞，檢測BHMT蛋白表達,Western blot檢測可以觀察到47 kD附近處有特征條帶，大小與目的基因融合蛋白吻合。提示此質粒用FLAG抗體檢測到BHMT，可在 293T細胞內正常表達，且在感染組中明顯高于對照組(圖 7)。

圖7 Western blot檢測轉染組(OE)與對照組(NC)BHMT蛋白表達

討 論

前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(iTRAQ)標記的蛋白質組學技術研究分析了不同年齡人白內障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質, 并首次報道了BHMT在高齡組白內障晶狀體核區的水平較年輕組明顯下調，進一步通過新的臨床白內障晶狀體標本進行了驗證[6]。但其在晶狀體老化和白內障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。Rao 等[7]第一次在恒河猴的晶狀體核中發現了BHMT，其表達約占核部總蛋白的 0.5%～10%，但具體機制不清。人源 BHMT的研究表明，BHMT 是含 Zn2+的金屬酶，相對分子量為 45×103,由 406 個氨基酸組成[8]。Met 或谷胱甘肽與白內障的發生密切相關[9-10]。BHMT 是 Met 循環中重要的酶, 是Hcy代謝過程中重要的酶類，在對高Hcy血癥的研究中發現，BHMT 表達與生物學活性降低是高 Hcy 血癥發生的分子基礎, 它可以調控 Hcy 的水平。BHMT 是 Hcy 重新甲基化生成 Met 的關鍵酶，是機體在生理狀況下維持 Hcy穩定代謝水平的重要功能蛋白質。高 Hcy 除了與心血管疾病、神經性疾病、糖尿病等全身疾病相關外[11-12]，與白內障等眼部疾病的發生發展密切[13-17]。研究發現在相同的誘導條件下BHMT 轉基因小鼠的高 Hcy 血癥發病率明顯低于對照組，并可保護肝臟細胞免受高Hcy濃度的損傷[18]。Zhang等[19]發現兩種miRNAs 通過分化靶向海刺參中 BHMT 來直接影響體腔細胞中Hcy 含量，靶基因BHMT siRNA 或補充Hcy均可明顯促進體腔細胞 ROS 的產生，表明靶基因BHMT通過調控Hcy的含量發揮生物學功能。更值得關注的是, BHMT 不僅對已生成的 Hcy 具有高效直接的轉化功能，且由于與細胞膜有很好的親和性，外源性 BHMT 能被吸收入細胞發揮生物學功能。因此，調控或直接補充 BHMT 已經成為高Hcy 血癥治療研究的一個新的重要熱點。

慢病毒(Lentivirus)載體是基于人類免疫缺陷型病毒(HIV)發展起來的基因治療載體，它對分裂細胞和非分裂細胞都具有感染力，能在體內較長期表達且安全性高。慢病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒[20]，目前已廣泛應用在以基因為靶點的各種基礎實驗研究中。通過慢病毒載體系統，我們能有效地將目的基因整合入宿主細胞基因組中，從而得到可以穩定表達目的基因的細胞株，是研究基因及其表達產物功能的有力工具。我們首次在人老年性白內障晶狀體核中篩選鑒定出了BHMT 的表達降低，非常有必要明確其表達的變化與老化和白內障形成的機制。本實驗成功構建并包裝了重組 BHMT-GV358慢病毒載體，成功轉染293T細胞，采用RT-PCR 在mRNA 水平檢測到BHMT表達明顯增加，說明BHMT BHMT-GV358能夠有效介導BHMT的過表達，并用構建成功的BHMT基因過表達的慢病毒載體在體外有效感染了人晶狀體上皮細胞，為進一步研究BHMT在 白內障及與Hcy有關的疾病發病機制中的作用打下了良好的實驗基礎。