WT1基因在骨髓增生異常綜合征患者外同血中的表達及臨床意義

聶澤強,李曉云,馬爻芳,方 敏,鮑 杰

山西省運城市中心醫院血液科(運城 044000)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome, MDS)是一種造血干細胞惡性髓系克隆性疾病，且高風險向急性白血病轉換[1]。MDS向白血病演變是一個多因素作用的多步驟、多階段的過程。WT1基因(Wilms tumor type 1, WT1)最早是從Wilms’瘤患者染色體11q13位點分離出來的一種抑癌基因[2]。WT1基因在正常造血系統、細胞分化及增殖過程中起著重要的作用，特別是近年來發現它在惡性血液病中有異常高表達，有類癌基因樣活性，并認為其在造血細胞的生長和分化過程中發揮重要作用[3-4]。目前已證實WT1基因在急性白血病中均高表達，可以作為白血病的一個泛白血病標志[5-6]，MDS作為急性白血病(Acute leukemia, AL)前期，其與WT1的關系備受關注，WT1基因是否在MDS中同樣高表達，與MDS病情進展是否有明顯相關性，可否作為MDS向急性白血病轉變的一個重要檢測指標，目前尚未定論，為此我們進行了相關研究,現報道如下。

對象和方法

1 研究對象 選擇48例初治MDS患者的外周血標本為MDS組，男27例，女21例，中位年齡57.5歲，按照WHO診斷標準診斷[7]，其中RA /RAS 12例，RCMD 14例，RAEB16例，RAEB215例，MDS/MPD 1例。按照國際預后評分系統(IPSS)分組：低危組5例，中危Ⅰ組 25例，中危Ⅱ組 11例，高危組 7例。另選取4例繼發于MDS的AML患者外周血標本為MDS-AL組，M11例，M22例，M51例，男女各2例，中位年齡43歲。正常對照組:非惡性血液病患者和正常人共10例為正常組，男6例，女4例，中位年齡49.8歲。

2 實驗方法

2.1 總RNA提?。簩⑿迈r外周血標本用淋巴細胞分離液，分離出有核細胞，然后加入RNA裂解液(Trizol)，其后先后加入氯仿、異丙醇提取總RNA。

2.2 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。①內參及目的基因引物序列：β-actin，上游5‘-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游5‘-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，PCR產物540bp；Wt1:上游5‘-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3’，下游5‘-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3’，PCR產物481bp。②逆轉錄(RT)反應。分別取RNA 2 μl，Oligo(dt)primer 1 μl，DEPC H2O 9 μl共計12 μl,放于PCR儀中，65℃ 5 min后分別加入5×Reaction buffer 4 μl，Ribolock Rnase Inhibitor(20 U/μl)1 μl，10 mmol/L dNTP Mix 2 μl，RevertAid M-MulV Reverse Transcriptase(200 U/ μl)1 μl共計20 μl，再分別42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min得到反應產物(cDNA)，可直接進行PCR或者暫存于-80℃冰箱備用。③PCR反應。反應體系：20 μl由2×PCR Mix 10 μl，上下引物各1.0 μl，cDNA 2.0 μl，用RNase Free dH2O補充至總體積20 μl進行PCR擴增,每次試驗均設β-actin作為內對照，K562細胞株作為陽性對照。擴增條件：β-actin:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s , 55 ℃、30 s, 72 ℃、40 s, 30 循環; 72 ℃、7 min；WT1：94 ℃、7 min，94 ℃、1 min, 64 ℃、1 min, 72 ℃、1 min，35循環，72 ℃、6 min。

2.3 PCR產物分析：取產物于瓊脂糖凝膠(2%)中電泳(100 V，30 min)，采用Tanon GIS2010數碼圖像處理系統觀察結果，以同一標本的WT1/β-actin的灰度值比表示WT1的半定量。

3 統計學方法 應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計學分析，采用χ2檢驗，Fisher檢驗和Spearman’s相關進行統計。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 正常組、MDS組、MDS-AL組WT1表達情況 見表1。WT1的陽性率及表達水平MDS-AL組均明顯高于MDS組及正常組，MDS組也均明顯高于正常組，三組之間兩兩相比差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 WT1mRNA在正常人、MDS、MDS-AL的表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05；與MDS組比較，△P<0.05

2 WT1mRNA表達情況與IPSS的關系 見表2。將48例MDS重新按照IPSS評分系統分組，WT1mRNA的表達水平在高危與中危及低危組之間有統計學差異(P<0.05)，中危與低危組之間沒有統計學差異(P>0.05)。中危Ⅰ組與中危Ⅱ組之間也沒有統計學差異(P>0.05)。WT1基因表達水平與IPSS評分值有相關性(圖1)(r=0.74，P<0.05)。

表2 WT1mRNA在MDS的表達情況(灰度值)

注：與高危組比較,*P<0.05

圖1 WT1mRNA與IPSS的相關性

3 WT1基因與原始細胞的關系 WT1基因的表達水平與MDS患者骨髓外周血原始細胞百分比之間有顯著相關性(圖2)(r=0.66,P<0.05)。

圖2 WT1表達與MDS原始細胞百分比的關系

4 動態隨訪MDS患者WT1的表達情況 動態隨訪2例RA患者WT1基因表達情況(1例從RA→RAEB2→AML-M2→CR→復發→2個月后死亡，另外1例患者由RCMD→RAEB1→AML-M2A→CR),可以看出WT1基因的表達隨著病情的進展而升高，經過化療完全緩解后，WT1水平再次下降至最初水平(圖3)。

圖3 2例MDS患者隨病情進展WT1動態監測

討 論

WT1基因作為一種類癌基因能促進惡性造血細胞的增殖、抑制惡性造血細胞的分化，目前認為是急性白血病的一個獨立預后指標[8-9]。因其在白血病初治階段及復發時明顯高表達，治療后表達水平下降，國內外已經將其作為監測白血病微小殘留的標識[4,10]，并被部分移植中心作為是否移植及移植后復發的預測指標[11-13]。而MDS作為一種高風險向急性白血病轉變的疾病，該類疾病的WT1基因的表達水平如何，動態監測WT1基因的水平是否有助于對疾病的預判，目前尚未定論。

本研究通過對48例初治MDS患者及10例正常人的外周血標本中WT1基因進行RT-PCR監測，結果表明在MDS中WT1mRNA的陽性表達率(27.1%)明顯高于正常對照組(0)，MDS-AL組的WT1mRNA陽性表達率(100%)明顯高于正常對照組及MDS組，均有統計學意義(P<0.05)，表明WT1基因在MDS中明顯高表達，與MDS密切相關，與已有文獻一致[12,14]。在白血病發病機制研究中發現：WT1基因可協調促進DNA基因高甲基化，促進血液系統的惡性分化[15-16]；同時目前已明確表觀遺傳學的改變在MDS的發生發展中起著重要的作用，尤其是抑癌基因的異常甲基化是MDS發生、發展的主要原因[17]，故WT1基因的高表達表明著其可能在MDS中起著一個重要作用。

國際預后評分(IPSS)與MDS向白血病轉換幾率有明顯的相關性[18]。為了進一步明確WT1基因是否可作為疾病進展的評估指標，對48例MDS患者重新按照IPSS評估，分為低危，中危Ⅰ組，中危Ⅱ組，高危組4組。結果發現從低危到高危，WT1基因的陽性表達水平依次升高，且在高危組患者中明顯高表達；高低危組相比有明顯的統計學差異，而中危Ⅰ與中危Ⅱ組之間沒有明顯統計學差異，中危組與正常人的WT1水平亦無明顯統計學差異。經相關性分析，提示WT1基因的表達水平與IPSS評分有明顯的相關性。 報道另外，對WT1水平和原始細胞比例進行了相關性分析，結果仍提示具有明顯的相關性，考慮與WT1基因主要在惡性造血細胞中高表達，而在正常造血細胞中低表達或不表達有關，故隨著MDS由低危向高危，乃至白血病的進展，其WT1基因表達水平亦隨之升高，提示WT1基因在MDS的惡性演進過程中起著重要作用。

動態隨訪2例RA患者WT1基因表達情況：1例RA患者(WT1mRNA陰性)，僅給予對癥治療，2個月轉變RAEB2(此時WT1mRNA陽性)，給予去甲基化治療1療程，1個月后轉為AML-M2(WT1表達水平較前升高)，4個療程去甲基化治療后達完全緩解，WT1表達水平較RAEB2階段下降但仍高于初發階段；1月后復發，WT1表達水平再次升高且較AML-M2階段高，此患者2月后死亡。另1例為RCMD患者(WT1mRNA陰性)，支持對癥，2個月后轉為RAEB1(WT1mRNA陰性)，再次支持對癥，2月后轉為AML(WT1mRNA陽性)，去甲基化及小劑量CAG方案化療1療程后達完全緩解，此時WT1基因再次下降至最初水平。故我們認為WT1基因可以作為預測MDS病情進展及療效評估的一個早期指標，與盧丹等[19]的研究一致。

本次研究得出以下結論：①WT1基因在各類型MDS均出現高表達，且與疾病的進展呈正相關，高危組的WT1表達明顯高于低中危組。②WT1基因表達水平與MDS患者的原始細胞百分比密切相關，與IPSS評分有明顯相關性，可作為臨床上對MDS病情的評估、判斷預后的重要指標之一。③通過2例病人的動態隨訪，推測WT1基因可以作為預測MDS患者病情和療效評估的重要指標。但由于隨訪的病例數有限，仍需進一步驗證。