強(qiáng)直性脊柱炎患者血清RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)及臨床意義

沈 健,張雨涵 ,曹芳蕾, 郗萌萌

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(錦州 121001);2.遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院(錦州121001)

強(qiáng)直性脊柱炎臨床較為常見，是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚的慢性炎性病變，以骶髂關(guān)節(jié)炎、附著點(diǎn)炎及脊柱融合為特征[1]。細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor κB ligand, RANKL)是炎性相關(guān)因子，在慢性炎癥的發(fā)生和進(jìn)展中有一定作用，近年研究認(rèn)為與骨的炎癥病變進(jìn)展有關(guān)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)和轉(zhuǎn)化生長因子β2(Transforming growth factor-β2, TGF-β2)具有纖維細(xì)胞趨化因子的功能，可以促進(jìn)炎癥各時(shí)期病變的發(fā)展[3]。本實(shí)驗(yàn)檢測強(qiáng)直性脊柱炎患者血清中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的含量，分析其臨床意義，以期為臨床診斷提供輔助指標(biāo)。

資料與方法

1 一般資料 選擇2016年2月至2018年6月在我院診斷和治療的強(qiáng)直性脊柱炎患者202例作為觀察組。其中男102例，女100例，年齡24～85歲，中位年齡43.3歲。納入患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)二位副主任醫(yī)師以上職稱人員復(fù)核確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有糖尿病、感染及其它自身免疫性疾病的患者；②惡性腫瘤；③原發(fā)性高血壓及有內(nèi)臟器官病變者；④近3個(gè)月有外傷史的患者。選擇體檢證實(shí)為無明顯器質(zhì)性疾病的成人血清標(biāo)本98例作為對照組，其中男49例，女49例，年齡22～65歲，中位年齡44.81歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

2 研究方法 觀察組于確診后、對照組于清晨均常規(guī)性抽取空腹靜脈血3 ml，室溫靜置30 min后，3000 r/min,離心15 min，分離血清，保存于-20℃冰箱中備用。RANKL、TGF-β1和TGF-β2試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)公司，應(yīng)用ELISA法檢測三種因子的表達(dá)。嚴(yán)格按說明書操作。即首先向反應(yīng)板各孔加入100 μl待測樣品，置于37℃孵育2 h；反應(yīng)板洗滌、吸干后，加入100 μl一抗稀釋液，混勻，置于37℃孵育1 h；反應(yīng)板洗滌、吸干后，加入100 μl酶標(biāo)抗體稀釋液，混勻，置于37℃孵育30 min；反應(yīng)板洗滌、吸干后，加入100 μl終止液，混勻；于20 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。全程做好質(zhì)控工作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，行t檢驗(yàn)、方差分析和卡方檢驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2表達(dá)的比較 見表1。兩組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，即觀察組中高表達(dá)。

表1 兩組血清中RANKL、TGF-β1和TGF-β2表達(dá)的比較(μg/L)

注：與對照組比較，*P<0.01

2 觀察組不同骨關(guān)節(jié)侵蝕個(gè)數(shù)、不同附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)分組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2表達(dá)比較 見表2。觀察組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)與在不同骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)及附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 觀察組不同骨關(guān)節(jié)侵蝕個(gè)數(shù)、不同附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)分組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2表達(dá)比較(μg/L)

3 觀察組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)與血清中CRP表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用相關(guān)性分析觀察三種因子與血清中C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示觀察組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2均與血清中CRP的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

4 觀察組中RANKL、TGF-β1和TGF-β2表達(dá)的相關(guān)性分析 應(yīng)用相關(guān)分析顯示觀察組中RANKL和TGF-β1(r=0.45,P=0.0421)、RANKL和TGF-β2(r=0.42,P=0.0415)、TGF-β1和TGF-β2(r=0.41,P=0.0460)之間的表達(dá)具有正相關(guān)性。

討 論

強(qiáng)直性脊柱炎是一種可嚴(yán)重影響骨平衡過程的炎性關(guān)節(jié)性疾病，病變形成和發(fā)展過程中血清和組織中的炎性相關(guān)因子的表達(dá)可出現(xiàn)明顯異常[4]。RANKL主要來源于骨組織，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子會(huì)迅速結(jié)合RANK的胞質(zhì)區(qū)，當(dāng)RANK與TRAF6結(jié)合后，激活誘導(dǎo)激酶，引起破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子激活，當(dāng)免疫系統(tǒng)低下時(shí)，骨組織處于炎性反應(yīng)狀態(tài)，RANKL分泌更多。也有研究認(rèn)為RANKL是一種抗凋亡因子，主要參與人體的脂質(zhì)代謝、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等[5]。RANKL同時(shí)也是一種載鐵蛋白，參與胚胎的生長發(fā)育，其通過介導(dǎo)Fe3+向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，保證早期上皮細(xì)胞的分化，在上皮損傷時(shí)保護(hù)上皮組織免受Fe3+催化損傷并有效地抑制凋亡[6]。有研究認(rèn)為在炎癥病變時(shí)RANKL可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞和損傷肝上皮細(xì)胞的再生，這也是炎癥反應(yīng)中早期表達(dá)的蛋白之一，血清中也能檢測到其表達(dá)[7]。TGF-β1和TGF-β2是經(jīng)雙硫鍵聯(lián)結(jié)的具有多種生理功能的多肽，是轉(zhuǎn)化生長因子β的一種異構(gòu)體，在多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。兩種因子均作為成纖維細(xì)胞趨化因子，在骨性病變的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，TGF-β1和TGF-β2可促進(jìn)炎性病變中IL-1和IL-6等相關(guān)因子的表達(dá)，其可能與多種細(xì)胞因子的調(diào)控相關(guān)[9-10]。

本研究結(jié)果顯示強(qiáng)直性脊柱炎患者血清中RANKL、TGF-β1和TGF-β2高表達(dá)，提示三者是病變形成的重要因素。結(jié)果顯示RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)與在不同骨侵蝕關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)及附著點(diǎn)炎關(guān)節(jié)個(gè)數(shù)的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三者高表達(dá)促進(jìn)病變的進(jìn)展，尤其是促進(jìn)病變過程中的關(guān)節(jié)損傷。相關(guān)分析顯示觀察組中強(qiáng)直性脊柱炎患者血清中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示三者間具有正向協(xié)同作用，其調(diào)節(jié)作用可能是間接性的，主要與成骨生長肽 (Ostegenic growth peptide, OGP)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)等橋接蛋白有關(guān)。RANKL是RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)通路中的細(xì)胞因子，在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，可以調(diào)控骨吸收，并增加骨皮質(zhì)和強(qiáng)度，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的成熟。強(qiáng)直性脊柱炎中RANKL的表達(dá)升高與病變炎性損傷有關(guān)，其可能具有雙向性，既具有損傷后的保護(hù)和修復(fù)作用[11]，同時(shí)由于其具有的炎性刺激作用，因此使其在保護(hù)作用的同時(shí)又具有對骨細(xì)胞的破壞作用[12-13]。TGF-β1和TGF-β2具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織纖維化的作用，因此其表達(dá)升高時(shí)，局部的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度增加，細(xì)胞周圍的膠原含量增加，實(shí)質(zhì)細(xì)胞及空間減少，引起細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積，細(xì)胞老化明顯[14-16]，無菌性炎癥增加，細(xì)胞凋亡加速，使骨關(guān)節(jié)的功能下降并呈現(xiàn)明顯的僵硬化[17]。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)三種因子與CRP的關(guān)系，提示三者與CRP之間無明顯通路及橋接作用的機(jī)制。CRP是機(jī)體中的早期炎癥相關(guān)蛋白，RANKL也與炎癥早期的病變相關(guān)，二者之間無相關(guān)性，說明RANKL與CRP的調(diào)節(jié)通路可能不同，而TGF-β1和TGF-β2不具有早期炎癥反應(yīng)因子的作用，其主要參與中、晚期炎癥反應(yīng)的形成及繼發(fā)性的骨關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)變。但是RANKL、TGF-β1和TGF-β2的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需要更多的研究來進(jìn)行闡明。

總之，RANKL、TGF-β1、TGF-β2高表達(dá)對病變的形成和進(jìn)展具有明確的作用，三者間具有正相關(guān)性。聯(lián)合檢測血清中RANKL、TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)可能成為強(qiáng)直性脊柱炎的早期診斷標(biāo)志物，其機(jī)理與強(qiáng)直性脊柱炎是炎性病變的機(jī)理有關(guān)。