慢性腎臟病礦物質和骨異常患者血清白細胞介素-18、分泌型Klotho和骨保護素的表達及意義

富 麗,劉勝陽,張寶桐,任麗麗,郭冬慈,吳 丹,張繹平 ,靳蕊霞

1.錦州醫科大學研究生學院(錦州121000);2.遼寧省遼陽市中心醫院血液透析室(遼陽 111000)； 3.錦州醫科大學附屬第一醫院腎內科(錦州121000)

慢性腎臟病礦物質和骨異常(Chronic kidney disease-mineral and bone disorder,CKD-MBD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)常見并發癥之一，包括血清標志物的改變、骨組織的改變及軟組織鈣化等，當腎小球濾過率(Glomerular filtration rate, GFR)下降時，高磷血癥的發生率增加，此時可以觀察到血清中相關指標的變化，包括微炎癥性改變及相關的細胞因子的改變[1]。白細胞介素-18(Interleukin-18, IL-18)是促炎細胞相關因子，其可以激發機體中白細胞介素家族中的其它成員的活性，誘發炎性及免疫性的級聯反應[2]。抗衰老蛋白Klotho在血清中以分泌型Klotho(Secretory Klotho ,sKlotho)存在，是近年關注重要的細胞因子，其表達升高時可以抑制炎癥反應，對腎組織等臟器可能具有保護作用[3]。骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)作為腫瘤壞死因子受體家族的重要成員，主要由上皮細胞和間葉細胞分泌，在血管鈣化時發揮自分泌和旁分泌的作用，誘導細胞出現水腫[4]。本實驗檢測IL-18、sKlotho和OPG在CKD-MBD患者血清中的含量，分析其臨床意義。

資料與方法

1 一般資料 選擇2017年1月至2019年1月在我院診斷和治療的CKD-MBD患者共55例作為觀察組，男29例，女26例，年齡35～75歲，中位年齡48.9歲。選擇CKD的患者50例為對照組，男25例，女25例，年齡34～67歲，中位年齡47.6歲。選擇無明顯器質性疾病的成年人50例作為正常對照組，男25例，女25例，年齡22～60歲，中位年齡45.9歲。三組在基線資料比較中無統計學差別。本研究經倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。CKD納入標準：腎損害≥3月，伴或不伴GFR下降。CKD-MBD診斷標準：①血清鈣、磷、全段甲狀旁腺激素(Intact parathyroid hormone，iPTH)或維生素D代謝異常；②骨轉化、礦化、骨量或骨強度異常；③血管或其他軟組織鈣化。上述伴隨癥中有一點即可診斷。排除標準：①骨折等原發性骨疾病；②佝僂病史；③惡性腫瘤；④大劑量糖皮質激素；⑤肝、膽疾病；⑥腎移植患者；⑦甲狀旁腺手術史患者。

2 研究方法 觀察組在確診后、對照組于清晨均常規性抽取空腹靜脈血3 ml，室溫靜置30 min后，3000 r/min,離心15min，分離血清，保存于-20℃冰箱中備用。IL-18、sKlotho和OPG試劑盒均購自武漢博士德生物技術公司，應用ELISA法檢測三種因子的表達。嚴格按說明書操作。簡要步驟：向反應板各孔加入100 μl樣品,37℃孵育2 h；洗滌、吸干，加入100 μl一抗，混勻,37℃孵育1 h；洗滌、吸干后，加入100 μl酶標抗體稀釋液后，在37℃環境中孵育30 min；板洗滌、吸干后，加入100 μl終止液，混勻；于20 min內用酶標儀測定450 nm處吸光度。全程做好質控工作。

3 統計學方法 應用SAS 6.12統計學軟件進行分析，計量資料兩組間的比較行t檢驗，計量資料多組間的比較行方差分析，組間計數資料率的比較行卡方檢驗，相關性分析應用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 三組中IL-18、sKlotho和OPG表達比較 見表1。三組中IL-18、sKlotho和OPG的表達應用SNK法進行兩兩比較差別有統計學意義(P<0.05)，即觀察組中高表達。

表1 三組血清中IL-18、sKlotho和OPG表達的比較

2 觀察組不同GFR和基礎疾病分組中IL-18、sKlotho和OPG表達比較 見表2。觀察組中IL-18、sKlotho和OPG在不同GFR水平的表達差別有統計學意義，三者在不同基礎疾病情況的表達中差別無統計學意義。

表2 觀察組不同GFR和基礎疾病分組中IL-18、sKlotho和OPG表達比較(ng/L)

3 觀察組中IL-18、sKlotho和OPG的表達與血清中iPTH、ALP表達的相關性 應用相關分析顯示觀察組中IL-18與iPTH(r=0.46，P=0.042)、IL-18與堿性磷酸酶(ALP)(r=0.42，P=0.045)存在正相關性，sKlotho、OPG與iPTH、ALP之間均無相關性(P>0.05)。

4 觀察組中IL-18、sKlotho和OPG表達的相關性分析 應用相關分析顯示觀察組中IL-18和sKlotho、IL-18和OPG、sKlotho和OPG之間的表達均無明顯相關性(P>0.05)。

討 論

CKD-MBD是指由慢性腎疾病引起的繼發性病變。近年研究認為其病變發展時機體可以出現微炎癥的狀態。IL-18是炎癥相關因子，由中性粒細胞的趨化，肝細胞、內皮細胞、間葉細胞入其它活性因子均可以分泌IL-18，對機體的免疫有一定作用[5]。IL-18能在微炎環境中誘導細胞變形，分泌少量的超氧化物和溶酶體酶，促進炎癥反應。IL-18能對NK細胞有一定的調節作用，能促進CD4+和CD8+陽性的淋巴細胞的增殖，使輔助T細胞分化。在IL-18起作用的過程中，機體中多種因子可以有協同作用[6]，sKlotho蛋白即為與IL-18有關的細胞因子，不僅與炎癥反應有關，還參與哺乳動物的抗衰老過程，近年研究顯示sKlotho也與代謝性疾病的發生、發展密切相關，其合成不足時可引起各種機體退性相關的癥狀和疾病[7]。Klotho主要有兩種形式，即膜結合型和分泌型。膜結合型Klotho主要在腎臟、前列腺和胎盤的上皮成分中表達；分泌型Klotho是膜結合型Klotho在激酶誘導下產生的，不含跨膜區域和胞內結構，表達為游離的狀態，在血液和尿液中大量存在，其高表達時被認為與機體的保護作用有關[8]。多種炎性因子可以上調OPG的含量。研究認為OPG的表達升高能加重腎上皮細胞和間質細胞的水腫，加速腫瘤細胞的分解，研究顯示有效的抑制OPG的表達，能減少血管壁的通透性，減少炎細胞的游出，降低炎癥的微環境[9]。OPG能激活IL-6和IL-23等炎癥相關介質，引起腎及骨組織的損傷。

研究結果顯示CKD-MBD中IL-18、sKlotho和OPG的表達明顯高于CKD和正常對照組，提示三種因子在CKD-MBD的病變發展中起作用。結果顯示IL-18、sKlotho和OPG在不同GFR水平的表達差別有統計學意義，提示三者參與病變的進展。結果顯示IL-18與iPTH、IL-18與堿性磷酸酶(Alkaline phosphates,ALP)的表達具有正相關性，提示其具有正向協同作用。ALP 是一組同工酶，來源于肝、腎臟和白細胞等，ALP在結構和功能正常時均提示骨組織是正常的，其為正常骨細胞的標志物。因此ALP表達變化在慢性腎臟病中的標記作用可能更有意義，主要與血清中ALP的表達常不受GFR的影響有關。ALP可能是鈣化性病理變化的始動因素。ALP的失活能減少膠原纖維的鈣化。實驗中顯示出IL-18與ALP具有明顯正相關性，提示IL-18正常表達可能也在一定程度上反應ALP的血清含量，IL-18也是重要的監測指標。CKD 患者常規檢查iPTH用于監測骨細胞的異常轉化情況。PTH在骨轉化時可影響成骨細胞、破骨細胞及其他骨細胞的結構和相關功能[10]。但是PTH 的生物變異度高，其與營養狀態和炎癥反應等有關[11]。本研究中顯示IL-18與iPTH有一定的相關性，提示IL-18對病變的形成有重要作用。也有研究認為IL-18可能具有多向作用，由于PTH并不是一個低轉運CKD-MBD的診斷指標，因此IL-18可能在一定程度上反應骨轉化情況[12]。IL-18、sKlotho和OPG的調節通路可能不同，而sKlotho和OPG不具有早期炎癥反應因子的作用，其主要參與中、晚期炎癥反應的形成及繼發性的骨組織轉變[13]。但是IL-18、sKlotho和OPG的具體調節機制尚需要更多的研究來進行闡明。實驗未發現IL-18、sKlotho和OPG之間具有相關性，提示三者間不具有協同作用。

總之，IL-18、sKlotho和OPG高表達在CKD-MBD中有重要作用，三者的表達水平與病變的進展有關。IL-18與iPTH和ALP存在正相關性。聯合檢測血清中IL-18、sKlotho和OPG的表達可能成為CKD-MBD的早期診斷標志物，其機制與CKD-MBD是炎性病變的機制有關。