四逆散對慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠的作用及機制研究*

錢元霞，湯玲珺，錢 禎，黃曉凡，高 靜，徐衛東△

1. 江蘇省鎮江市中西醫結合醫院藥劑科(鎮江 212000)；2.江蘇大學藥學院(鎮江 212013)

目前，胃癌的發病率和死亡率在全球居惡性腫瘤的第二位，嚴重威脅著人類的健康，我國每年新發病例約40萬例，占世界總發病例數的42%[1]。一般認為，胃癌的發生發展過程為：慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-不典型增生-胃癌，胃癌前病變(Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)指在慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)基礎上伴發腸上皮化生和異型增生的病理狀態[2]。現代醫學對胃癌前病變尚缺乏療效肯定的治療藥物及理想的治療方法，中醫藥從“未病先治”角度出發，抑制或阻斷PLGC的發生發展顯示獨特優越性。四逆散為漢代張仲景所創，由柴胡、白芍、枳實、甘草組成，四藥合用，既有調理肝脾之功，又具調和氣血之能。四逆散及加味治療慢性萎縮性胃炎及癌前病變在臨床上有一定的療效[3-5]，但其作用及機制并不十分清楚，本實驗運用現代藥理學和分子生物學等技術，探討四逆散抑制或逆轉慢性萎縮性胃炎癌前病變的作用及機制，為中藥復方的研究及更好的應用于臨床提供依據。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，60只，4周，體重100～120g，由江蘇大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXH(蘇)2013-0011，飼養條件、每籠10只，溫度保持在(22±2)℃，相對濕度(55±5)%。經醫院醫學實驗動物管理委員會批準。

2 藥物與試劑 柴胡、白芍、枳實(炙)、甘草(炙)購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，上述藥材均由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定；N-甲基-N'-硝基-N'-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)、核黃素：梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；胃蛋白酶原I (Pepsinogen I，PG I)、胃蛋白酶原Ⅱ(Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)及胃泌素-17(Gastrin-17，G -17)購自sinobestbio公司；兔抗鼠的β-actin多克隆抗體，兔抗鼠的PCNA多克隆抗體、兔抗鼠的Bax多克隆抗體、鼠抗鼠的Bcl-2多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗(美國Proteintech公司)。

3 主要儀器 Spectra Max Gemini熒光酶標儀(美國Molecular Device公司),熒光正置顯微鏡(Olympus Corporation)。

4 造模與分組 正常組、模型組、四逆散低劑量組、中劑量組、高劑量組、核黃素組，每組10只，正常組大鼠每天喂基礎飼料，飲用水自由飲用，其余各組具體的造模方法為：200 μg/L 的MNNG液，自由飲用，配以饑飽失常處理，即2 d飽食，1d禁食，共 8 周。于實驗第8周末，從模型組中隨機取2只大鼠，取胃組織，常規HE染色，光鏡下2只大鼠均有胃黏膜萎縮性病變，確認模型是否復制成功。第9周開始給藥，四逆散各組每天按10 ml/kg給藥，核黃素組每天1 g/kg。14周后，腹腔注射戊巴比妥鈉處死全部大鼠，留取標本觀察指標。

5 實驗給藥 參照《中華人民共和國藥典》中藥制劑通則：按四逆散處方等比例取炙甘草、枳實、柴胡、白芍藥材，加水10倍浸泡3 h，煎煮2次(第1次8倍量，第2次6倍量)，每次1 h，分離藥渣，保留藥液。將所有藥液混勻濃縮，分別濃縮至0.25 g/ml、0.5 g/ml、1 g/ml，各組合并濾液，4 ℃冰箱儲存備用。

6 觀察指標

6.1 一般狀況觀察:每天觀察大鼠的精神狀態、飲食、大便性狀、毛發光澤度等，每周記錄體重變化。

6.2 臟器指數檢測:給藥結束后，計算各組大鼠臟器系數。大鼠器官腎臟、肝臟、脾臟、胸腺稱重后計算：①腎臟指數(Kidney index，KI) = 腎臟重量(g) /體重(100g)；②肝臟指數(Liver index，LI) = 肝臟重量(g) /體重(100g)；③脾臟指數(Spleen index，SI) = 脾臟重量(g) /體重(100g)；④胸腺指數(Thymus index，TI) = 胸腺重量(g) /體重(100g)。

6.3 HE染色法觀察胃黏膜組織病理變化:將大鼠禁食24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射(0.8～1.0 ml/只)后，無菌條件下剖腹，取出整個胃體，并沿胃大彎剪開，無菌生理鹽水沖洗，除去胃內容物，取胃竇部組織置于10%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋處理后，HE染色作病理組織學檢查。

6.4 ELISA方法檢測血清 PG I、PGⅡ及 G -17的含量:采血前禁食不禁水12 h以上，麻醉后通過頸靜脈取血，靜置30 min，離心(2000 轉/min)10 min分離血清。血清用0.2 μm微孔濾膜除菌。應用 ELISA 法測定血清 PG I、PGⅡ及 G -17的含量，計算PGR(PGⅠ/ PGⅡ)，所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行。

6.5 Western blot檢測蛋白的水平:各組大鼠隨機選取6只，剖腹取胃，漂洗干凈后，于胃竇部取米粒大小組織，剪碎成 1 mm ×1 mm ×1 mm 大小，加入蛋白質抽提試劑，用勻漿器每次30 s低速勻漿，14000 g離心15 min，上清液立刻轉移入新的離心管中保存待用。提取組織總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，封閉液封閉1 h，一抗孵育4 h，TBST清洗3次，二抗孵育，室溫1 h，TBST清洗3次，ECL發光液發光，Minichemi 發光成像儀檢測。

7 統計學方法 采用Graph Pad Prism 5.0 統計軟件，Anova方差分析，組間比較采用q檢驗，數據以平均數±標準差表示，P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 大鼠一般狀況觀察 正常組大鼠活潑，毛發有光澤，身體強壯，飲食正常，體重自然增加，大便顆粒狀，余亦無殊。模型組大鼠豎毛，精神較萎靡，體重增長減緩，食欲下降，大便時溏，余亦無殊。各四逆散治療組與核黃素組癥狀較模型組有所改善。

2 四逆散對大鼠體重及免疫器官系數的影響 正常組大鼠體重平均從192.9 g增加至258.1 g，平均增加65.2 g，模型組平均增加48.2 g，低劑量組平均增加46.0 g，中劑量組平均增加48.3 g，高劑量組平均增加 14.5 g，核黃素組平均增加53.0 g，其中四逆散高劑量組體重增長趨勢最緩，給藥6周后與各組相比有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠的體重變化

表1顯示藥物對大鼠免疫器官和代謝器官的影響，與正常組、模型組相比，藥物處理組肝臟、脾臟系數無明顯差異。四逆散高劑量組的大鼠腎臟系數與正常組相比有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組胸腺系數與模型組相比較低，有顯著性差異(P<0.05),劑量濃度較大可能對大鼠體重有影響，而臟器系數的下降可能由高劑量組體重明顯下降所致。

3 胃黏膜形態及病理觀察 肉眼觀察，正常組大鼠胃黏膜正常，色澤淡紅光滑，皺壁完整，無充血、水腫。模型組大鼠皺壁平，胃壁彈性差，黏膜充血、水腫。四逆散治療組及核黃素各組胃黏膜色淡紅，胃壁彈性較模型組好，水腫癥狀減輕。光鏡下正常組胃黏膜上皮完整，腺體排列規則。模型組有的粘膜不完整，表面可見脫落的變性、壞死的上皮細胞，核增大，染色質密集深染，有不同程度的異型性，部分伴腸上皮化生。四逆散治療組胃黏膜腸上皮化生程度較模型組輕，尤其是中高劑量組和核黃素組(圖2)。

表1 各組大鼠臟器系數的比較(g/100g)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

A：正常組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：核黃素組圖2 各組大鼠胃黏膜組織形態的光鏡觀察(HE染色,×400)

4 四逆散對血清 PGⅠ、PGⅡ、PGR及 G-17含量的影響 由表2可看出，模型組PGⅠ濃度與正常組相比均值較低，但無顯著性差異，核黃素組PGⅠ濃度較模型組顯著升高(P<0.05)；PGⅡ濃度模型組與正常組相比明顯升高，四逆散中劑量、高劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05)；模型組PGR值與正常組相比明顯降低，四逆散中、高劑量組、核黃素組與模型組相比明顯升高(P<0.05)；模型組G -17濃度較對照組低，高劑量組、核黃素組G -17濃度較模型組顯著升高(P<0.05)。

表2 各組血清 PGⅠ、PGⅡ、PGR及 G -17含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

5 PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達量 由圖3及表3可看出，與正常組比較模型組Bax蛋白表達有所降低，差異有統計學意義(P<0.05);四逆散處理組能夠升高Bax蛋白的表達。模型組PCNA、Bcl-2蛋白量與正常組相比較高，差異有統計學意義(P<0.05),四逆散治療后，中、高劑量組與模型組相比Bcl-2表達量降低(P<0.05)；高劑量組PCNA與模型組相比表達量明顯降低(P<0.05)。

圖3 四逆散對PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達量的影響

組 別nBaxBcl-2PCNA正常組100.21±0.04 0.32±0.07 0.14±0.04 模型組80.07±0.01*0.50±0.12*0.55±0.19*低劑量組90.17±0.06#0.52±0.09*0.49±0.11*中劑量組100.20±0.02#0.30±0.03#0.54±0.03*高劑量組80.18±0.07#0.35±0.05#0.31±0.09#核黃素組90.25±0.08#0.36±0.07#0.40±0.04*

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》診斷標準擬定證候診斷,將慢性萎縮性胃炎分為脾胃虛弱型、肝胃不和型、脾胃濕熱型、胃絡瘀血型、胃陰不足型5型[6]。胃癌前病變多由慢性疾病發展而來，久病失調，導致脾胃之氣損傷，脾胃虛弱，中氣不足，運化失司，則胃受納腐熟乏力，出現納呆痞悶、口淡無味、胃脘隱痛、嘔吐清涎、神疲乏力等表現[7]。如《景岳全書》謂：“胃強則寒不能侮,而寒能勝之，總由脾氣之弱耳”。“脾胃虛弱”為慢性萎縮性胃炎及其癌前病變的發病之本，“邪踞胃脘、久釀成毒”是CAG及其癌前病變發展、演變的病理基礎和關鍵因素，“脾胃肝同病”是其癌前病變常見的病機變化，“脾虛及腎”是其癌前病變病機演變的轉歸，“脾虛絡阻、虛實夾雜”是貫穿CAG癌前病變始終的基本病機[8]。故脾胃虛弱是胃癌前病變的病機演變的必然結果及關鍵所在，脾胃虛弱，氣機升降失調，運化不力，治宜健脾益氣，溫中和胃。四逆散中柴胡為君藥，能透達郁陽，疏肝解郁；芍藥為臣藥，柔肝平肝，養血斂陰，與柴胡相伍，疏肝而不傷陰，一散一斂，有相反相成之效；枳實為佐藥，理氣消積，以利脾胃，與柴胡相配，一升一降，可增強疏肝理氣之功；炙甘草為使藥，不僅可補益脾胃，還可調和諸藥，與芍藥合用能柔肝緩急，酸甘化陰，四藥合用，既有調理肝脾之功，又具調和氣血之能。

本研究采用MNNG方法復制慢性萎縮性胃炎癌前病變模型，MNNG是一種在環境中廣泛存在的化學誘變劑和致癌劑，可誘導胃癌前病變大鼠模型的建立[9]。以不同劑量的四逆散給藥，核黃素作陽性對照，發現四逆散高劑量組可能對大鼠的體重、腎臟、胸腺有一定的影響，還需擴大樣本研究。四逆散能改善病變大鼠胃粘膜形態和腸上皮化生程度，升高PGⅠ、PGR 、G-17，降低PGⅡ水平。PGⅠ和 PGⅡ，主要由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌，血清 PG 的水平反映了胃蛋白酶的分泌及不同部位胃黏膜的形態和功能情況，當胃黏膜病變累及分泌胃蛋白酶原的細胞時，血清中的 PG 含量也隨之改變[10]。研究發現，在胃癌前及胃癌病變患者的血清中，PGR較正常組明顯降低，其可作為異型增生、胃癌，尤其是腸型胃癌的診斷標記，G-17反應胃粘膜的狀態，與胃粘膜萎縮程度及癌變程度有關[11-13]。

腫瘤的發生發展與細胞增殖與凋亡平衡密切相關，PCNA是細胞增殖的指標,與腫瘤等細胞增殖性疾病的發生和發展存在相關性，PCNA在胃癌的發生發展過程中是一個逐漸變化的過程[14-15]。Bcl-2是線粒體上的一種跨膜抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，Bax可以在線粒體外膜上形成孔道,Bcl-2則可通過與 Bax結合阻礙線粒體轉運孔道的開放。線粒體外膜通透性增大時，Cty C等凋亡相關蛋白從線粒體釋放入胞漿，可導致凋亡小體形成，激活半胱氨酸蛋白酶家族成員Caspase-3的活性，最終導致凋亡[16]。研究發現細胞的Bcl-2和Bax 基因異常表達與引起胃粘膜細胞凋亡和增殖異常，胃癌及癌前病變的形成發揮一定作用[17-18]。本研究表明四逆散在一定程度上影響PCNA及Bcl-2、Bax蛋白的表達，調控細胞的增殖凋亡過程。

綜上所述，四逆散在治療慢性萎縮性胃炎癌前病變中有一定的治療作用，能夠在一定程度上改善胃粘膜異型增生程度，可能與調控細胞增殖與凋亡平衡有關，有待進一步研究。