二仙湯抗化療性卵巢早衰氧化應激的效應觀察

饒晨晨 高文雅 陶仕英 崔麗霞 石丹寧 牛建昭 趙丕文 孫麗萍 王燕霞

〔摘要〕 目的 觀察二仙湯對卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）大鼠的抗氧化應激效應。方法 雌性SD大鼠40只，監測一周動情周期，篩選有正常動情周期的大鼠入組，隨機分為4組：正常組、模型組、陽性藥組和二仙湯組。除正常組外，其余3組使用順鉑注射液造POF模型，陽性藥組和二仙湯組在造模同時進行藥物干預，灌胃期間監測動情周期，15 d后麻醉取材，應用放免法檢測血清性激素卵泡刺激素（follicle timulating hormone， FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone， LH）及雌激素（estrogen， E2）的水平以及氧化應激相關指標丙二醛（malondialdehyde， MDA）、抗氧化指標超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化氫酶（catalase， CAT）的含量，顯微鏡下觀察各組卵巢組織的病理改變。結果 與正常組相比較，模型組大鼠動情周期及動情間期明顯延長（P<0.01），血清FSH、LH、MDA含量顯著升高（P<0.01），E2、SOD及CAT水平顯著降低（P<0.01），卵巢組織中閉鎖卵泡增多，竇卵泡數減少。與模型組相比，陽性藥組與二仙湯組動情周期縮短（P<0.05或P<0.01），血清FSH、LH、MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），E2、SOD及CAT的含量顯著上升（P<0.05或P<0.01），閉鎖卵泡數量減少，竇卵泡數增多。結論 二仙湯能通過調節POF大鼠的的抗氧化能力來改善卵巢功能，減少氧化應激帶來的損傷從而治療POF。

〔關鍵詞〕 卵巢早衰;二仙湯;氧化應激;雌激素;黃體生成素

〔中圖分類號〕R285.5;R711.75 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the anti-oxidative stress effect of Erxian Decoction on rats with premature ovarian failure（POF）. Methods A total of 40 female SD rats were monitored the estrus cycle and then chose the rats that had the normal estrus cycle into the experiment. The rats were randomly divided into 4 groups： a normal group， a model group， a positive drug group and an Erxian Decoction group. Except the normal group， the other 3 groups were made POF model by using cisplatin injection. The positive drug group and the Erxian Decoction group were given drug intervention at the same time， and estrus cycle was monitored during gastric administration. After 15 days， anesthesia and killed， the levels of follicle stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH）， estrogen （E2）， malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） were measured by radioimmunoassay， and the pathological changes of ovarian tissues in each group were observed under microscope. Results Compared with the normal group， the estrous cycle and estrous interval in the model group were significantly prolonged （P<0.01）. The levels of FSH， LH and MDA were significantly increased （P<0.01）， and the levels of E2， SOD and CAT were significantly decreased （P<0.01）. Atresia follicles in ovarian tissue increased， and the number of antral follicles decreased. Compared with the model group， the estrus cycle in the positive drug group and the Erxian Decoction group was shortened （P<0.05 or P<0.01）， and the serum FSH， LH and MDA levels were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The levels of E2， SOD and CAT were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and the number of atresia follicles and sinus follicles were decreased in the positive drug group and Erxian Decoction group， and the number of sinus follicles was increased in the positive drug group and the Erxian Decoction group. Conclusion Erxian Decoction can improve ovarian function by regulating the antioxidant capacity of POF rats and reduce the damage caused by oxidative stress， and then cure POF.

〔Keywords〕 premature ovarian failure; Erxian Decoction; oxidative stress; estrogen; luteinizing hormone

卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）是指育齡期女性卵巢功能提前衰退，出現閉經和性器官萎縮，以卵泡刺激素（follicle timulating hormone， FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone， LH）水平升高、雌激素（estrogen， E2）降低為特征的一種婦科內分泌性疾病[1]。POF患者主要表現為月經失調、閉經、不孕、性功能降低、圍絕經期綜合征以及烘熱汗出、腰膝冷痛、生殖器及第二性征逐漸退化的類更年期癥狀等一系列癥狀。POF的發病率為1%～3%[2]，隨著生活壓力的逐漸增加，POF近些年來的發病率呈上升趨勢。目前對于POF的治療，西醫多采用雌孕激素替代療法[3]，要起到治療作用需要長期服藥，且停藥后容易復發。

順鉑是臨床上常用的化療藥物，順鉑有較強的細胞毒性，在殺死腫瘤細胞的同時也對正常細胞造成損傷，順鉑對細胞的損傷主要是通過造成DNA損傷實現的。DNA損傷激活細胞內多條信號通路，最終誘導細胞凋亡，氧化應激也是順鉑誘導細胞損傷的機制之一。順鉑對育齡期的女性生殖功能產生影響，破壞卵巢功能導致POF，順鉑是造大鼠POF模型常用的藥物[4]。

二仙湯由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、知母和黃柏組成，是已故名醫暨上海中醫藥大學張伯訥教授的常用方，溫腎益精的同時調理沖任，起到平衡陰陽的作用，對POF有顯著的治療效果。本實驗旨在從氧化應激角度觀察二仙湯對順鉑致POF大鼠的干預作用。

1 實驗材料

1.1 ?實驗動物

清潔級Sprague Dawley 雌性大鼠40只，7周齡，體質量為（200±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物質量許可證編號為SCXK（京）2016-0002（合格證編號11401500028866）。大鼠飼養在室溫20～24 ℃、相對濕度45%～55%、自然光照12 h時的清潔級實驗室內，食水充足。飼料為斯貝福提供的大鼠維持飼料，飲水為去離子水。

1.2 ?主要藥品與試劑

注射用順鉑，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產。補佳樂（雌激素）購自北京中醫藥大學東直門醫院，規格：1 mg/片，由拜耳醫藥有限公司生產。二仙湯組成：淫羊藿15 g，仙茅10 g，巴戟天15 g，知母10 g，當歸15 g，黃柏10 g。二仙湯免煎顆粒購買于北京中醫藥大學東直門醫院。FSH、LH、E2試劑盒購于北京華英生物技術研究所，丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化氫酶 （catalase， CAT）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 ?實驗動物篩選

大鼠適應性喂養6 d后，采用陰道脫落細胞涂片法檢測動情周期。每日上午7～8點進行陰道涂片，在載玻片上標記大鼠分組及編號，取醫用棉簽用生理鹽水浸透，將棉簽緩緩插入大鼠陰道，轉動棉簽2～3圈沾取陰道分泌物，隨后再緩慢抽出棉簽，旋轉著將棉簽上的分泌物均勻涂抹在載玻片上，涂抹時注意不要重疊涂抹。在載玻片上滴加亞甲基藍溶液至完全覆蓋住分泌物，（亞甲基藍溶液組成：亞甲基藍0.6 g、95%乙醇30 mL、KOH 0.01 g以及蒸餾水100 mL），5～10 min后用清水洗去亞甲基藍溶液，用濾紙吸干多余水分，在光學顯微鏡下觀察各種細胞的分布比例，判斷大鼠動情周期。篩選動情周期正常的大鼠進行實驗。

2.2 ?分組造模與干預

將40只動情周期正常的大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和二仙湯組，除正常組外，其余3組利用順鉑造大鼠POF模型：用0.9%氯化鈉溶液將順鉑注射液配制成0.5 mg/mL的溶液，按成人有效劑量折算成大鼠所需劑量，按6 mg/kg進行腹腔注射，連續兩次注射順鉑注射液，間隔時間為7 d[5]。造模期間每日上午7：00-8：00進行陰道脫落細胞涂片實驗，觀察大鼠陰道上皮動情周期變化。造模的同時對大鼠進行灌胃干預，給藥劑量按大鼠體質量系數換算，相當于成人等效劑量：陽性藥組灌胃補佳樂溶液0.009 mg/kg，二仙湯組灌胃二仙湯溶液7.81 g/kg（二仙湯顆粒劑10.25 g相當于飲片75 g，按此比例將顆粒劑稀釋成1 g/mL的二仙湯溶液），正常組和模型組灌胃等容量的雙蒸水，每日早8：00及晚5：00灌胃，連續15 d。

2.3 ?大鼠一般狀態觀察

觀察大鼠的精神狀況、活動狀態、皮毛顏色、毛發脫落狀況、體質量變化、進食量以及飲水量等。 ? ? ? ? 2.4 ?大鼠動情周期觀察

造模期間每日上午7：00-8：00進行大鼠陰道脫落細胞涂片實驗，通過在顯微鏡下觀察涂片上的細胞種類和數量來判斷大鼠處于動情周期的階段并記錄數據。

2.5 ?大鼠血清激素指標檢測

大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min離心后分離上層血清，按照試劑盒說明書操作方法分別測定FSH、LH和E2水平。

2.6 ?大鼠血清氧化與抗氧化指標檢測

大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min離心后分離上層血清，按照試劑盒說明書操作方法分別測定MDA、SOD和CAT水平。

2.7 ?大鼠卵巢指數觀察

大鼠麻醉后取雙側卵巢，去掉卵巢周圍的結締組織、脂肪組織等多余的成分，稱質量，計算大鼠的卵巢指數。

卵巢指數=雙側卵巢濕質量/體質量×100%

2.8 ?卵巢組織病理學觀察

大鼠麻醉后取卵巢，用4%多聚甲醛固定后經常規石蠟包埋切片，行HE染色觀察卵巢組織切片中卵泡狀態和數量，評估卵巢功能。

2.9 ?統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，實驗數據采用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊則用非參數檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?大鼠一般狀態觀察

正常組大鼠精神狀態良好，飲食正常，活動靈敏，體毛脫落較少、毛發有光澤，體質量明顯穩定增加，動情周期正常。模型組大鼠精神不佳，食欲低下，活動遲緩，喜弓背蜷縮，食欲下降，飲水減少，毛發枯黃無光澤且大量脫落，體質量增加遲緩甚至有的體質量下降。模型組大鼠與正常組大鼠相比較，體質量明顯降低（P<0.01）。陽性藥組和二仙湯組的大鼠精神狀態、活動情況和毛發脫落情況與模型組相比有所改善，與模型組相比較，體質量明顯上升（P<0.01）。見表1。

3.2 ?大鼠動情周期變化

正常組大鼠動情周期維持在4～6 d，分為4期：動情前期、動情期、動情后期以及動情間期。動情前期大鼠卵巢上的黃體退化，卵泡開始發育，雌激素分泌增加，動情前期的大鼠陰道涂片上大部分為橢圓形有核的上皮細胞，伴有少量白細胞（見圖1-A）。動情期的大鼠卵泡發育較快，陰道上皮角質化，動情期陰道涂片的特征是有大量無核角化的上皮細胞，偶爾能看到少量的橢圓形上皮細胞，光鏡下可以看到這些無核上皮細胞成片出現，類似落葉狀聚集（見圖1-B）。動情后期大鼠開始排卵，排卵后新的黃體逐漸形成，腺體分泌減少，動情后期的陰道涂片表現為多種細胞同時存在，包括無核的角化上皮細胞，橢圓形的有核上皮細胞和白細胞（見圖1-C）。動情間期大鼠卵巢黃體逐漸生成，子宮內膜回縮，動情間期的陰道涂片最大的特征是有大量小而圓的白細胞，以及少量的有核上皮[6]（見圖1-D）。

模型組大鼠動情周期紊亂，較正常組相比動情周期顯著延長（P<0.01），動情間期延長最為明顯（P<0.01），甚至長期停留在動情間期，而動情期與正常組相比較顯著縮短（P<0.01）;陽性藥組與模型組相比，動情周期顯著縮短（P<0.01），動情間期縮短（P<0.05），動情期延長（P<0.05）;二仙湯組與模型組相比較，動情周期顯著縮短（P<0.01），動情間期縮短（P<0.05），動情期有所延長（P<0.05）。見表2。

3.3 ?各組大鼠血清LH、FSH和E2的比較

與正常組相比較，模型組大鼠血清FSH、LH顯著升高（P<0.01），E2水平顯著下降（P<0.01）;和模型組相比，陽性藥組和二仙湯組血清中FSH水平和LH水平顯著降低（P<0.01），E2水平顯著升高（P<0.01）。結果見表3。

3.4 ?各組大鼠血清氧化與抗氧化指標的比較

與正常組相比較，模型組大鼠血清MDA水平顯著升高，SOD、CAT水平顯著下降（P<0.01）;和模型組相比，陽性藥組和二仙湯組MDA水平明顯降低（P<0.01），SOD、CAT水平顯著升高（P<0.01）。結果見表4。

3.5 ?各組大鼠卵巢指數比較

與正常組相比較，模型組卵巢指數顯著降低（P<0.01）;和模型組相比較：陽性藥組和二仙湯組卵巢指數顯著升高（P<0.01）。見表5。

3.6 ?各組大鼠卵巢形態學改變

正常組卵巢卵泡形態正常，可見各級卵泡，卵泡顆粒細胞較多，卵泡液豐富，閉鎖卵泡較少;模型組與正常組相比卵巢萎縮，皮質變薄，出現大量閉鎖卵泡，竇卵泡較少，卵泡腔中卵泡液減少且形態不規則，卵泡顆粒細胞減少，炎性細胞浸潤增多;陽性藥組跟模型組相比，竇卵泡增多，閉鎖卵泡數量減少，炎性細胞浸潤減少;二仙湯組與模型組相比較，卵泡顆粒細胞增多，卵泡液豐富，閉鎖卵泡數量減少，竇卵泡增多，炎性細胞浸潤減少。結果見圖2-3。

4 討論

POF是臨床上常見的婦科疾病，POF患者由于卵巢功能提前衰退，出現生殖方面的問題[7]。POF的病因多且復雜，有遺傳因素、免疫因素等，大多數特發性POF尚不能找到明確的病因。POF歸屬于中醫學中“月經過少”“不孕”“閉經”的范疇，患者“腎氣-天癸-沖任-包宮”軸功能提前衰退，腎虛是POF最主要的病機，肝郁和心脾虛也能促進POF的發病。

二仙湯治療POF療效顯著，方中仙茅、淫羊藿及巴戟天是臨床常用的補益藥，三藥合用起到溫腎陽補腎精的作用，黃柏與知母瀉腎火滋腎陰，通過溫腎益精、理沖任緩解POF患者陰陽兩虛的癥狀，有效改善卵巢功能[8]。

本研究結果顯示：模型組FSH和LH升高，E2降低，病理結果提示卵巢功能下降，POF模型建立成功;經過二仙湯干預后，大鼠血清中的FSH和LH含量下降，E2含量上升，卵泡發育正常，卵巢功能好轉，表明二仙湯能夠通過調控POF大鼠的激素的正常表達來改善卵巢的功能，發揮治療POF的作用。

動情周期的變化過程與激素水平密切相關，動情前期大鼠卵巢上的黃體退化，卵泡開始發育，雌激素分泌增加，動情期的大鼠卵泡發育較快，雌激素的分泌達最高水平，孕激素分泌達最低水平，動情后期大鼠開始排卵，排卵后新的黃體逐漸形成，孕激素分泌開始增多，動情間期大鼠卵巢黃體逐漸生成，在整個動情周期中，FSH和LH都起著至關重要的作用，二仙湯干預后大鼠的動情周期與模型組相比較明顯縮短，動情期延長的同時動情間期縮短，進一步表明了二仙湯可以通過調節激素水平從而改善卵巢功能，幫助卵巢恢復正常的排卵過程。

模型組大鼠卵巢指數降低，二仙湯能夠上調卵巢指數，表明二仙湯能促進卵巢的生長。POF可導致患者不孕，HE染色的結果表明經二仙湯干預后大鼠卵巢中閉鎖卵泡數量下降，成熟卵泡增多，且卵巢顆粒細胞增多，卵泡的正常生長及排卵是卵巢最重要的功能之一，二仙湯有助于恢復卵泡的生長發育，維持卵巢的正常功能，從而幫助POF者受孕。

POF的發病尚有未知之處，有研究表明氧化應激與POF的發病有一定的相關性。在生理狀態時機體的氧化與抗氧化能力處于平衡狀態。氧化應激是指機體在遭受有害刺激時，體內的高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產生過多，氧化程度超出氧化物的清除程度，自由基無法及時清除以至于在機體內累積，氧化系統和抗氧化系統失衡，自由基的過量產生導致中性粒細胞炎性浸潤，使蛋白酶分泌增加，產生過多氧化中間產物，從而導致組織損傷[9]。氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用，是導致衰老和誘發多種疾病的一個重要因素[10]，氧應激和脂質過氧化損傷在POF的發病中有著不可忽視的作用。

氧化應激過程中的中間產物之一就是脂質過氧化物，MDA是不飽和脂肪酸在自由基攻擊下形成的脂質過氧化物，它可以與蛋白質的游離氨基作用，引發蛋白質分子內和分子間的交聯從而導致細胞損傷[11]，MDA的含量可反映機體受損和老化的程度。SOD和CAT可清除體內自由基，有抗氧化的作用[12]，SOD可以清除體內多余的超氧陰離子，SOD將超氧陰離子歧化為氧氣和過氧化氫，CAT和過氧化物酶則可以清除產生的過氧化氫[11]，在SOD和CAT的作用下，機體內多余的自由基得到清除，恢復機體氧化和抗氧化的平衡，減少氧化應激帶來的損傷。

本研究結果顯示：POF模型組大鼠血清中MDA含量升高，SOD和CAT下降，模型組的大鼠處于氧化應激的狀態，表明氧化應激和抗氧化系統障礙是POF的一個重要發病機制。二仙湯干預后大鼠血清中MDA含量較模型組明顯下降，SOD和CAT含量跟模型組相比明顯升高，表明二仙湯能夠有效協助機體清除自由基過多產生的中間產物，改善氧化應激狀態。因此調節和改善氧化與抗氧化系統的代謝平衡，可能是二仙湯防治POF的作用機制之一。

綜上所述，二仙湯可能是通過下調MDA、上調SOD和CAT的含量來清除機體多余的自由基，調節自由基和過氧化物的代謝平衡，緩解氧化應激給機體帶來的損傷，從而改善卵巢的功能，達到有效治療POF的目的，然而對其在抗氧化方面的機制有待進一步深入研究。

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