丹參多酚酸鹽B對糖尿病大鼠認知功能及凋亡通路的影響

王金華 黃睿 張葉青 張丹紅 柯博熙 陳富強

丹參多酚酸鹽B是從丹參中提取的一種水溶性酚類化合物，在丹參中含量十分豐富[1]。在神經系統疾病的治療方面，丹參多酚酸鹽B主要應用于缺血性腦血管病的治療，具有抗氧化應激、改善突觸可塑性、抑制凋亡等重要作用[2]；丹參多酚酸鹽B還具有改善血管性癡呆大鼠和Aβ沉積引起的癡呆鼠認知功能的作用[3-4]。另有研究證實丹參多酚酸鹽B能通過調節血糖和脂類代謝有效治療糖尿病和肥胖性疾病[5-6]。然而，丹參多酚酸鹽B對糖尿病大鼠認知功能是否產生影響，相關研究報道較少。因此，本研究擬觀察丹參多酚酸鹽B對糖尿病大鼠認知功能的影響，并探討其具體機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雄性健康SPF級SD大鼠38只，由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供。每籠2～3只飼養，所有動物均可隨意進食水。室內溫度控制在21～25°C，動物房采用12h白天/黑夜循環周期的光照。所有實驗程序均遵循神經科學研究關于哺乳動物的照料與使用規定。

1.2 主要試劑 丹參多酚酸鹽B（120418）購于上海綠谷制藥有限公司；B細胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）（ab196495）、Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（ab232479）、β-actin（ab179467）抗體均購于英國abcam公司。

1.3 分組和丹參多酚酸鹽B藥物注射 38只大鼠采用隨機數字表法抽取10只作為對照組，常規飼養；剩下28只制作糖尿病大鼠模型。大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）60mg/kg（9g STZ 溶于 1L 0.9%檸檬酸鹽緩沖劑，6.7ml/kg），注射后72h采集尾靜脈血液，采用血糖儀檢測血糖水平，血糖＞16.7mmol/L視為糖尿病模型制作成功。共有20只大鼠造模成功，再采用隨機數字表法分為模型組和治療組，每組10只。對照組大鼠給予檸檬酸鹽緩沖劑（6.7ml/kg）。模型制作成功后1周，治療組大鼠給予丹參多酚酸鹽B 20mg/kg（3g丹參多酚酸鹽B溶于1L 0.9%氯化鈉溶液，6.7ml/kg）腹腔注射治療，1次/d，連續6周。對照組和糖尿病組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液（6.7ml/kg）腹腔注射治療，1次/d，連續6周。

1.4 血糖測定 實驗開始及治療結束時，取大鼠尾靜脈血液，利用血糖儀測量各組大鼠血糖水平。

1.5 Morris水迷宮測試大鼠空間學習和記憶能力 丹參多酚酸鹽B治療結束后第2天進行Morris水迷宮檢測。水迷宮水池桶直徑1.5m、高0.5m，池內水深40cm，水溫控制在21～24℃。隱性平臺（直徑10cm）位于水面下1cm處，放置在目標象限中央。前5d進行定位航行試驗，每只大鼠面朝池壁放入水池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠登上水下平臺的時間；第6天去除水下平臺，進行空間搜索實驗，記錄大鼠跨臺次數。

1.6 凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平檢測 采用Western blot法。每組隨機選取5只大鼠，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織。研磨海馬組織后加入RIPA裂解液，離心后取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉膜。TTBS 處理后與 Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗相結合，4°C 過夜。洗膜后與二抗相結合并孵育。利用凝膠成像系統顯影成像。采用Image Lab配套軟件分析系統對條帶進行半定量分析。蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值（IOD）/內參IOD值。

1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠治療前后血糖水平比較 3組大鼠實驗開始前血糖水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，與對照組比較，糖尿病組和治療組大鼠血糖水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠血糖水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 3組大鼠治療前后血糖水平比較（mmol/L）

2.2 3組大鼠逃避潛伏期和跨臺次數比較 與對照組比較，糖尿病組和治療組大鼠逃避潛伏期均延長，跨臺次數均減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠逃避潛伏期縮短，跨臺次數增多，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠逃避潛伏期和跨臺次數比較

2.3 3組大鼠海馬組織凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平比較 與對照組比較，糖尿病組和治療組大鼠Bax表達水平均升高，Bcl-2表達水平均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 3。

3 討論

糖尿病是世界上最常見的代謝紊亂性疾病，發病率呈逐年上升趨勢。2015年全世界大約有4.15億人患有糖尿病，到2040年，這個數字將達到6.42億[7]。糖尿病被公認為是影響認知功能障礙發展的獨立危險因素[8]。本研究證明STZ誘導的糖尿病模型大鼠出現了學習記憶的損傷，但經丹參多酚酸鹽B治療后，糖尿病大鼠的空間學習記憶能力明顯改善。

表3 3組大鼠海馬組織凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平比較

丹參多酚酸鹽B是一種重要的生物活性化合物，它是從中國傳統藥用植物丹參中提取的，具有抗炎、抗氧化和神經保護作用[9-10]。研究表明丹參多酚酸鹽B能夠維持神經干細胞/祖細胞的自我更新和增殖，從而保護神經元不受細胞凋亡的影響并減輕由短暫性腦缺血引起的學習和記憶障礙[11]。先前研究已表明，丹參多酚酸鹽B具有很強的抗氧化活性[12]，如防止脂質過氧化反應，抑制丙二醛形成，以及降低血管內皮細胞炎癥因子介導的細胞膜滲透性[13]。然而丹參多酚酸鹽B對于糖尿病相關認知功能障礙的作用機制的研究較少報道。

糖尿病導致認知功能障礙的機制仍不是十分明確。據報道，大鼠的慢性高血糖會導致大腦皮層神經元的顯著喪失，這可能會損害認知能力。動物研究表明，由STZ引起的慢性高血糖降低了大鼠腦中乙酰膽堿的合成和釋放，對于認知功能同樣造成影響[14]。本實驗發現丹參多酚酸鹽B治療后糖尿病大鼠的血糖水平明顯降低，這可能是其改善糖尿病大鼠認知功能的作用機制之一。細胞凋亡在神經系統發育和包括阿爾茨海默病在內的許多慢性神經退行性疾病的發展過程中起著至關重要的作用。有研究表明，凋亡的發生同樣是糖尿病相關認知功能障礙的重要生物學機制[15]。線粒體內在凋亡過程發生在線粒體中，主要涉及到Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族主要包括抗凋亡蛋白（如Bax）和促凋亡蛋白（如Bcl-2）。學習和記憶能力與許多大腦結構密切相關，如海馬區，因此本研究檢測了海馬區凋亡相關蛋白的表達情況。本研究發現糖尿病大鼠海馬組織Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低，應用丹參多酚酸鹽B治療后海馬組織Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高，提示丹參多酚酸鹽B明顯抑制了糖尿病大鼠海馬組織凋亡的發生，這可能是其改善糖尿病大鼠認知功能的重要機制。

綜上所述，丹參多酚酸鹽B治療可明顯改善糖尿病大鼠認知功能，其作用機制可能與提高Bax的表達并降低Bcl-2的表達，從而抑制凋亡通路密切相關。