煙草煙霧對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠發病的影響

謝建平 王趙偉 吳承龍 歷莎

煙草煙霧是哮喘、慢性支氣管炎等呼吸道慢性炎癥疾病的危險因素。煙草煙霧進入氣道后還能通過肺組織免疫活性細胞影響全身免疫功能狀態[1-2]。中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病是一類自身免疫性疾病，遺傳及環境因素與疾病的發生、發展密切相關。近期研究發現，煙草煙霧暴露是疾病的重要環境因素，但是研究證據尚不充分[3-4]。煙草煙霧室內污染在我國仍普遍存在，但對中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病的危害尚不明確也未引起重視[5]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是疾病動物模型。為探討煙草煙霧暴露對EAE的影響，筆者在制作大鼠EAE模型后進行煙草煙霧暴露處理，觀察大鼠行為學改變和星形膠質細胞形態變化，通過流式細胞術檢測脾臟樹突狀細胞比例及細胞表型變化，初步探索相關免疫機制。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 清潔級8周齡SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；完全弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；卡介苗購自中國食品藥品檢定研究院；FITC標記的MHC-Ⅱ抗體、APC標記的CD11c/b抗體及PE標記的CD86抗體購自美國eBioscience公司；小鼠抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）一抗與小鼠IgG kappa結合蛋白偶聯辣根過氧化物酶購自圣克魯斯生物技術有限公司。FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；某市售普通卷煙（每支含焦油11mg，煙堿1mg，一氧化碳11mg）。

1.2 動物分組及EAE模型制作 38只8周齡SD大鼠適應性飼養1周后分為3組，其中空白對照組6只，空氣組與煙草煙霧組各16只。空氣組與煙草煙霧組參考文獻[6] 制作EAE模型：10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠，再用左心室灌注0.9%氯化鈉溶液直到肝臟變白，再分離豚鼠脊髓，去除脊膜；加入等量無菌0.9%氯化鈉溶液后4℃環境勻漿。新鮮配制的豚鼠脊髓勻漿液與完全弗氏佐劑（含卡介苗8mg/ml）等體積混合，用2個注射器鏈接后于0℃冰水中反復抽打，直到形成油包水乳劑。現配上述乳劑用1ml皮試用注射器皮下注射于大鼠四肢足墊（0.4ml/只）。空白對照組不建EAE模型，同期注射0.9%氯化鈉溶液與完全弗氏佐劑混合的乳劑。空白對照組用于空氣組與煙草煙霧組發病大鼠對照，比較發病大鼠的行為學變化以及星形膠質細胞的形態學變化。皮下注射乳劑當天記為第0天。

1.3 煙草煙霧暴露 在EAE造模后進行煙草煙霧暴露或壓縮空氣暴露。參考文獻[7] 方法自制煙霧暴露系統，其中煙箱的容積為57.6dm2。煙草煙霧組在第1天到第20天每日8:00～11:00進行煙草煙霧暴露。煙草煙霧暴露時煙箱CO濃度維持在500mg/m3。空白對照組與空氣組在第1天到第20天每日8:00～11:00進行壓縮空氣暴露。1.4 行為學評分 從EAE造模當天到大鼠被處死，按參考文獻提供的標準[6]每天觀察記錄大鼠行為學評分。評分標準最高為5分，最低為0分。0分：無明顯異常；1分：尾巴無力；2分：輕微后肢無力；3分：嚴重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：瀕死或死亡。每天評分2次，均值為當日最終評分。從模型誘導到發病的時間段為潛伏期。整個觀察期內行為學評分最大值定義為最高行為學評分。從EAE發病到觀察期結束，每日行為學評分累積值定義為累積行為學評分。

1.5 星形膠質細胞形態學變化 采用免疫組織化學染色法。造模后第20天，采用10%水合氯醛麻醉大鼠后用無菌PBS灌注左心室的方法處死。分離腦脊髓組織后放入編號的容器內（含40g/L多聚甲醛）固定24h。再常規脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片、烤片后行免疫組化染色。其中染色步驟：石蠟切片脫蠟至水，高壓鍋加熱進行抗原修復（含0.01M的檸檬酸緩沖液中），PBS洗滌3次；滴加 GFAP一抗（1:300）后 4℃過夜，PBS洗滌 3次；滴加 m-IgGκBP-HRP（1:100）孵育 120min，PBS 洗滌3次；滴加DAB工作液（注意在光鏡下控制顯色時間）；去離子水洗滌；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機取3個視野觀察陽性細胞形態、分布。

1.6 脾臟樹突狀細胞比例及細胞表型變化檢測 分離脾臟后用注射器針頭反復穿刺獲得脾臟細胞；用紅細胞裂解液處理15min；離心5min（500g）后用PBS重懸洗滌2次；細胞計數器計數并稀釋到濃度為107/ml；用移液器吸取100μl于EP管，依次加入抗CD11c/b（樹突狀細胞標志物）、CD86和MCH-Ⅱ抗體，冰浴暗室孵育30min；PBS洗2次后上機檢測（FACSCantoⅡ流式細胞儀）樹突狀細胞比例、CD86+樹突狀細胞比例和MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。不符合正態的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗；符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 煙草煙霧組與空氣組大鼠潛伏期、行為學評分比較 空白對照組未發病。空氣組與煙草煙霧組大鼠在造模第9天左右開始發病，主要表現為進食及飲水量下降，行走時尾部上翹困難，步態拖沓。隨著病情加重，出現肢體無力，多以下肢無力開始，逐漸發展到四肢無力，甚至瀕死狀態，但沒有出現死亡。與空氣組比較，煙草煙霧組潛伏期更短，最高行為學評分、觀察期內累積行為學評分更高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 煙草煙霧組與空氣組大鼠潛伏期、行為學評分比較

2.2 3組大鼠星形膠質細胞形態變化 免疫組化染色顯示，相對于空白對照組，空氣組與煙草煙霧組大鼠腦組織均存在星形膠質細胞增生，表現為細胞體積增大，突起粗大并且增多。相對于空氣組，煙草煙霧組大鼠腦組織星形膠質細胞突起更為粗大，分布也更為廣泛，見圖1。

圖1 3組大鼠星形膠質細胞形態變化（a：空白對照組；b：空氣組；c：煙草煙霧組；免疫組化染色，×200）

2.3 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細胞表型的變化 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細胞比例和CD86+樹突狀細胞比例比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但煙草煙霧組大鼠MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例高于空氣組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2和圖2。

表2 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細胞表型的變化（%）

圖2 脾臟CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例比較（a：空氣組樹突狀細胞比例；b：煙草煙霧組樹突狀細胞比例；c：空氣組CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例；d：煙草煙霧組CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例）

3 討論

煙草煙霧對于健康的危害是多方面的，研究發現其是多發性硬化等中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病的重要危險因素[3,8]。通過SD大鼠EAE動物模型，筆者發現煙草煙霧組與空氣組比較，發病潛伏期縮短，最高行為學評分與累積行為學評分均更高，差異均有統計學意義。可見在疾病的啟動階段到疾病發展階段，煙草煙霧的吸入對EAE具有潛在的促發效應。進一步通過免疫組化染色發現星形膠質細胞在煙草煙霧暴露EAE大鼠中增生反應更加明顯，表現為胞體變大，突起更為粗大，這提示星形膠質細胞參與了中樞炎癥性反應，并可能與疾病的惡化存在潛在的關聯。空白對照組大鼠星型膠質細胞與空氣組及煙草煙霧組相比，細胞體積較小，突起也較為細小。且空白對照組均未出現行為學異常，結合上述兩點，提示星型膠質細胞參與EAE中樞炎癥性反應，其增值性反應可能是EAE炎癥的標志物。

煙草煙霧的吸入包括主動吸煙與被動吸煙。流行病學研究發現多發性硬化患者主動抽煙人群生活質量下降及疾病惡化情況較未吸煙人群更為明顯[9]，盡管主動抽煙與煙草煙霧被動吸入都可能加重此類疾病，但是目前機制還不明確[10-11]。

有研究發現煙草煙霧吸入可導致外周免疫調節性CD4CD25+T細胞比例下調，而IL-17+T細胞比例升高[12-13]，這種細胞免疫平衡紊亂可能是自身免疫性疾病發生、發展的關鍵環節。上述成熟的CD4+T細胞的發育與抗原遞呈細胞的免疫表型有密切關系。樹突狀細胞就是最為常見的外周抗原遞呈細胞，其免疫表型變化影響著幼稚T細胞的發育成熟。本研究發現，煙草煙霧組與空氣組樹突狀細胞比例和CD86+樹突狀細胞比例比較差異均無統計學意義，但煙草煙霧組大鼠MHC-Ⅱ+樹突狀細胞比例高于空氣組，差異有統計學意義。筆者推測煙草煙霧可能會影響樹突狀細胞MHC-Ⅱ表達上調，改變成熟CD4+T、CD8+T細胞表型以及功能，最終造成EAE發病過程中的細胞免疫功能紊亂。后續研究需要關注煙草煙霧對于樹突狀細胞、CD4+T、CD8+T細胞的分化與免疫功能的影響，以及與EAE中樞炎癥啟動、效應等階段的關系。

綜上所述，本研究初步發現煙草煙霧暴露與EAE病情惡化可能有關，并且伴隨著過度增生的星形膠質細胞。煙草煙霧可能通過促進樹突狀細胞MHC-Ⅱ表達上調促進致病性淋巴細胞活化，造成EAE發病加重。