神經(jīng)梅毒患者外周血淋巴細胞和NK細胞亞群的變化分析

李 磊 于芳芳 吳 月 張德發(fā) 高麗英 馬 萍

天津市第二人民醫(yī)院 300054

神經(jīng)梅毒是由梅毒螺旋體(TP)感染并侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)引起的CNS感染性疾病，其臨床表現(xiàn)形式復雜多樣，實驗室檢查缺乏特異性，極易誤診，嚴重危害人類健康。有研究認為，梅毒螺旋體(TP)的清除與機體的細胞免疫有關(guān)，T淋巴細胞對梅毒螺旋體所產(chǎn)生的免疫反應在其中起到了至關(guān)重要的作用[1]。為此本研究分析了神經(jīng)梅毒患者外周血中淋巴細胞亞群及NK細胞亞群的變化，為進一步探討免疫系統(tǒng)對TP的作用提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年10月在我院住院治療的神經(jīng)梅毒患者32例作為神經(jīng)梅毒組，其中麻痹性癡呆型12例(男7/女5)、腦膜血管型10例(男6/女4)、眼梅毒型4例(男2/女2)、混合型6例(男3/女3)。選取同期健康體檢者35例為健康對照組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 納入標準 目前國內(nèi)外均無神經(jīng)梅毒診斷的金標準，本研究確定入選標準參考中國CDC指南與共識[2]、美國CDC指南[3]、歐洲CDC指南[4]及相關(guān)文獻[5-7]：(1)有神經(jīng)梅毒的臨床癥狀和體征，并且腦脊液檢查梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)陽

表1 兩組一般資料對比

性，快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗(RPR)陽性。(2)任何階段的梅毒腦脊液RPR 陰性，但腦脊液梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)陽性，并具備下列2條者：①無其他已知原因引起的CSF蛋白≥0.5g/L并且白細胞(≥5×106/L)升高；②無其他已知原因所致的符合神經(jīng)梅毒的臨床癥狀和體征。其中符合(2)者為高度可疑神經(jīng)梅毒患者。所有入選患者血清TPPA、RPR均陽性；所有患者均行血清艾滋病病毒(HIV)抗體檢測，以排除HIV感染；腦脊液行墨汁染色、抗酸染色，以排除隱球菌感染及結(jié)核分枝桿菌感染。

1.3 研究方法 檢測方法：采取晨起空腹狀態(tài)下外周靜脈血進行檢測，采集量為2.0ml置于事先準備好的有抗凝劑的試管中，同時將20μl標記抗體置入另外一支試管中，將100μl加入抗凝劑的靜脈血樣置入標記抗體試管內(nèi)，搖勻后染色，持續(xù)15min后加入事先準備好的溶血素FACS 450μl，再次搖晃均勻并置于室溫下保存15min，離心5min棄上清液加入2ml PBS洗滌1次，最后加入0.5ml PBS重懸細胞，將最后得到的樣本2h內(nèi)置入流式細胞儀中對T細胞亞群進行檢測。所用試劑均購自美國BD公司，流式細胞儀型號為FACS Canto。

1.4 檢測指標 檢測各組患者血清中CD45+、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+/CD56+、CD4+/CD8+，并計算百分率，并進行統(tǒng)計學分析。目前臨床多以CD45+代表白細胞共同抗原、CD3+代表T淋巴細胞分化抗原、CD4+代表輔助性T細胞分化抗原、CD8+代表抑制性T細胞分化抗原、CD16+/CD56+代表NK細胞分化抗原。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以百分數(shù)(%)表示，定量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組定量資料比較時，當方差齊則采用t檢驗，方差不齊則采用U檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組淋巴細胞及NK細胞亞群比較 神經(jīng)梅毒組CD4+、CD19+高于健康對照組，CD45+、CD3+、CD16+/CD56+低于健康對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CD8+明顯低于健康對照組，CD4+/CD8+比值明顯高于健康對照組，兩組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表2。

表2 淋巴細胞亞群及NK細胞亞群檢測結(jié)果對比個/μl)

2.2 兩組淋巴細胞亞群及NK細胞亞群占比情況對比 神經(jīng)梅毒組CD3+%、CD8+%、CD16+/CD56+%均低于健康對照組，CD19+%高于健康對照組，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CD4+%神經(jīng)梅毒組顯著高于健康對照組，相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表3。

表3 淋巴細胞亞群及NK細胞亞群占比檢測結(jié)果對比

3 討論

神經(jīng)梅毒對人類危害大，致病機制不明，治療手段有限。目前研究認為梅毒侵犯人體與患者的細胞免疫及體液免疫之間有著密切的聯(lián)系[8-9]。基于T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞在人體免疫系統(tǒng)中強大的免疫調(diào)控作用，其在神經(jīng)梅毒患者體內(nèi)的起到什么樣的調(diào)節(jié)作用目前報道較少。本研究觀察并分析了神經(jīng)梅毒患者血清中淋巴細胞亞群的變化為進一步研究神經(jīng)梅毒提供依據(jù)。結(jié)果神經(jīng)梅毒患者抑制性T淋巴細胞明顯低于健康對照組；輔助性T淋巴細胞與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，但其高于健康對照組，T淋巴細胞總數(shù)低于健康對照組。表明神經(jīng)梅毒患者免疫調(diào)節(jié)失衡免疫功能降低，細胞免疫仍發(fā)揮主要免疫反應，但不能有效清除體內(nèi)的梅毒螺旋體，導致患者體內(nèi)梅毒的持續(xù)存在及組織損傷[10]，其免疫機制有待進一步研究證實。

有研究指出B淋巴細胞在機體清除TP方面并不起主要作用，推測這可能與TP表面的黏多糖保護膜有關(guān)，黏多糖、宿主蛋白等組成的保護層TP表面，保護TP不易被清除[11]；這與本研究發(fā)現(xiàn)的B細胞(主要為CD19+細胞)在神經(jīng)梅毒組與健康對照組相比無統(tǒng)計學差異相同，推測B淋巴細胞在神經(jīng)梅毒患者中清除TP作用有限，或者B淋巴細胞通過直接或者間接的細胞間相互作用來調(diào)節(jié)免疫耐受及抑制過度活化的免疫應答，導致神經(jīng)梅毒患者體內(nèi)梅毒的持續(xù)存在。

NK細胞是一類不需要特殊抗體參與、無需組織相容性復合物(MHC)類分子表達即可直接殺傷病原體或靶細胞的免疫細胞亞群[12]，與巨噬細胞構(gòu)成第一道免疫防線，起監(jiān)視功能并分泌細胞因子調(diào)節(jié)細胞免疫。多數(shù)學者認為NK細胞在清除機體TP感染方面起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞數(shù)在神經(jīng)梅毒與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但其明顯低于健康對照組，推測神經(jīng)梅毒患者下調(diào)或者降低NK細胞細胞毒功能，或者NK細胞分泌調(diào)節(jié)性細胞因子功能減低，減低其誘導的細胞免疫功能，最終導致機體清除TP功能受限，TP持續(xù)破壞神經(jīng)組織導致患者神經(jīng)損傷。

在神經(jīng)梅毒患者中，外周血中輔助性T淋巴細胞百分比明顯升高，抑制性T淋巴細胞百分比較健康對照組降低，這與Li等[13]研究早期梅毒患者發(fā)現(xiàn)外周血中輔助性T淋巴細胞亞群百分比低于健康人群，抑制性T淋巴細胞亞群百分比高于健康人群，結(jié)果相反。提示梅毒感染不同階段淋巴細胞免疫功能的變化，神經(jīng)梅毒患者細胞免疫功能仍起主要作用，但清除TP功能受損；神經(jīng)梅毒患者外周血中CD3+%、CD16+/CD56+%較健康對照組有降低，但降低不明顯，提示成熟T淋巴細胞及NK細胞在神經(jīng)梅毒患者中均降低，機體免疫力低于健康對照組。

總之神經(jīng)梅毒患者免疫功能降低、紊亂，機體清除TP功能受損，應該進一步研究TP與機體免疫功能之間的復雜關(guān)系，為臨床預防和治愈梅毒提供新的方法和手段。