基于脂類代謝組學研究對乙酰氨基酚對小鼠藥物性肝損傷的早期毒性Δ

楊虹，彭芳，劉剛，時京珍，錢海兵

（1.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴陽550002；2.貴州中醫藥大學科研處，貴陽 550002；3.貴州中醫藥大學教務處，貴陽 550002）

我國是藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）的高發國家，每年發生率至少為23.80/10萬人[1]。對乙酰氨基酚（APAP）是常見的復方抗感冒藥成分，也是導致DILI的常見藥物，由過量APAP導致的肝損傷發生機制復雜，涉及毒性產物生成、氧化應激、線粒體損傷以及炎癥反應等病理生理過程[2]。目前，臨床對DILI的診斷仍有很多不足，傳統檢測指標如谷氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）等存在敏感性低、特異性差的特點[3]，尚未找到理想的DILI生物標志物。

系統生物學方法為研究疾病發生機制提供了新的可能。目前，采用蛋白質組學、基因組學等方法發現，miR-122、miR-155、谷氨酸脫氫酶等在DILI的診斷方面有較高的價值[4-5]。但最新版《藥物性肝損傷診治指南》（2015年版）指出，新生物標志物在DILI診斷中的貢獻還有待進一步研究[6]。代謝組學是系統生物學領域繼基因組學、蛋白質組學后誕生的新興學科，脂類代謝組學是代謝組學的重要分支，用以描繪機體特定狀態下脂類代謝的整體輪廓。肝臟是人體最大的代謝器官，在脂類化合物的消化、吸收、合成、分解、運輸過程中發揮著重要作用，通過對脂類代謝輪廓的描述可以反映肝臟所處的病理生理狀態。而通過前期研究發現，以文獻報道的肝損傷劑量（300 mg/kg）[5]給小鼠使用APAP后1 h可發現肝中還原型谷胱甘肽（GSH）水平顯著降低，說明在該觀察點APAP肝損傷已經啟動。鑒于此，本研究以文獻報道的肝損傷劑量腹腔注射給予小鼠APAP，并用超高效液相色譜串聯三重四級桿飛行時間質譜法（UPLCTriple-TOF-MS）研究APAP給藥1 h后小鼠血漿中脂類代謝組學的改變情況，以期發現與APAP導致急性肝損傷發生發展過程相關的差異代謝物，為肝損傷的機制研究及發現早期肝損傷潛在生物標志物提供一定的研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

5600 UPLC-Triple-TOF-MS系統（美國AB Sciex公司）；EG1150石蠟包埋機、RM2245輪轉式切片機（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

對乙酰氨基酚標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S31044，純度：99%）；甲醇、甲酸為質譜純，均購自美國Fisher Chemical公司。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠20只，♂，18～22 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）-2014-0011。

2 方法

2.1 分組與給藥

小鼠于遵義基礎藥理教育部重點實驗室SPF級動物房中適應性飼養1周后，隨機分為正常組和APAP肝損傷組。APAP肝損傷組小鼠于4：00 p.m.－5：00 p.m.一次性腹腔注射APAP（300 mg/kg），正常組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。

2.2 血樣采集及處理

小鼠均于腹腔注射后1 h取血，將血樣置于肝素抗凝管中，立即緩慢搖勻，靜置1 h，然后以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得小鼠血漿。

2.3 UPLC-Triple-TOF-MS法檢測小鼠血漿中代謝產物

2.3.1 色譜條件色譜柱為BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈-異丙醇（1∶1，V/V）溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫；流速為0.4 mL/min；進樣量為20 μL，柱溫為40℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.3.2 質譜條件 樣品質譜信號采集分別采用正、負離子掃描模式，電噴霧離子源（ESI），電噴霧毛細管電壓、進樣電壓和碰撞電壓分別為1.0 kV、40 V和6 eV，離子源溫度和去溶劑溫度分別為120、500℃，載氣流量為900 L/h，質譜掃描范圍為質荷比（m/z）50～1 000，分辨率為30 000。

2.3.3 樣品制備與檢測 取小鼠血漿樣品100 μL，加入400 μL甲醇-乙腈（1∶1，V/V）溶液，混勻，冰上超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）萃取2次，每次15 min；然后將樣品置于－20℃條件下靜置30 min，再在4℃條件下以13 000×g離心15 min，取上清液，抽干；用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液復溶至100 μL，備用。按“2.3.1”“2.3.2”項下條件進樣分析。

2.4 數據采集與分析

2.4.1 代謝物的搜庫鑒定 質譜數據用代謝組學處理軟件Progenesis QI V2.4進行搜庫鑒定，將MS和MS/MS信息，包括代謝物的精確分子量、保留時間等與代謝數據庫進行匹配。主要鑒定數據庫為人類代謝組數據庫（The human metabolome database，HMDB），Metlin代謝組數據庫（Metlin metabolite database，簡稱“Metlin”）以及脂類圖譜數據庫（LIPID MAPS databases）。

2.4.2 主成分分析（PCA） 質譜數據經代謝組學處理軟件progenesis QI V2.4進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化處理后，最終得到一個保留時間、m/z和峰強度的數據矩陣。將歸一化后的數據矩陣導入SIMCA-P+14.0進行分析。采用無監督的PCA來觀察各樣本之間的總體分布和整體分析過程的穩定性，模型參數R2X表示所有主成分對變量的累積解釋率，數值越接近1說明模型擬合準確性越好。

2.4.3 偏最小二乘法分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 用有監督的PLS-DA及OPLS-DA來區分各組間代謝輪廓的整體差異。PLS-DA是一種有監督的分析方法，把各組分門別類，有利于發現組間的異同點。OPLS-DA是PLS-DA的衍生算法，進一步對不相關數據進行排除，可以更好地區分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。評價模型的參數有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這3個指標越接近于1時表示模型越穩定可靠，一般Q2＞0.5表示模型的預測能力較好。

2.4.4 脂類差異代謝物的分析 篩選OPLS-DA結果中變量重要性投影（Variable influence in the projection，VIP）＞1和studentt檢驗中P＜0.05的脂類代謝物為兩組比較的脂類差異代謝物[7]，差異倍數（Fold change，FC）＝正常組差異代謝物峰強度/APAP肝損傷組差異代謝物峰強度。根據該化合物的色譜響應強度（峰高、峰面積），對脂類差異代謝物和APAP進行相對定量分析[7]。并使用R語言，將所得脂類差異代謝物與APAP水平進行相關性分析，得到相關性系數r和P值，P＜0.05認為該脂類差異代謝物與APAP的水平顯著相關。

3 結果

3.1 UPLC-Triple-TOF-MS譜圖分析結果

在該檢測條件下，代謝物分離情況良好，兩種離子檢測模式具有很好的互補性，各成分的保留時間均在15 min以內，正常組和APAP肝損傷組樣品總離子流圖有一定區別。總離子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖Fig 1 TIC diagrams

3.2 PCA分析結果

本模型擬合參數R2X為0.787，說明建模理想。從PCA分析的散點圖中可以看出，正常組和APAP肝損傷組的樣品點分布在圖中不同的象限，說明正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿中整體代謝輪廓有很好的區分。結果見圖2。

圖2PCA分析圖Fig 2 Plot of PCAanalysis

3.3 PLS-DA、OPLS-DA分析結果

在本研究的分析過程中，選擇3個主成分作為最終建模所需數目，對應的R2Y和Q2數據如下：在PLS-DA分析中R2X＝0.753，R2Y＝0.987，Q2＝0.879；在OPLS-DA分析中R2X＝0.753，R2Y＝0.987，Q2＝0.905，說明建模情況良好。從兩種分析圖中可以看出，正常組和APAP肝損傷組各個樣品點分布于圖形不同的區域，具有良好的區分度，說明正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿中整體代謝輪廓存在明顯差異。PLS-DA和OPLS-DA分析圖見圖3。

3.4 脂類差異代謝物分析結果

APAP肝損傷組與正常組比較，共發現14個脂類差異代謝物，包括脂肪酰類（5個）、甘油磷脂類（8個）、鞘脂類化合物（1個）。且與正常組比較，APAP肝損傷組小鼠血漿中8個甘油磷脂類化合物和5，8，12-三羥基-9-十八碳烯酸、9-硫雜硬脂酸（脂肪酰類）水平顯著降低（P＜0.05），9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、十四烷二酸、L-肉豆蔻酰基肉堿（脂肪酰類）和Scyphostatin A（鞘脂類）水平顯著升高（P＜0.05）。相關性分析結果顯示，與血漿APAP水平[強度為（4.155±3.978）]顯著相關的脂類差異代謝物5個，分別為9-硫雜硬脂酸、十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、Scyphostatin A、L-肉豆蔻酰基肉堿（r分別為－0.708、0.579、0.612、0.736、0.928，P均＜0.05）。脂類差異代謝物鑒定信息見表1，脂類差異代謝物的相對表達結果見表2。

圖3PLS-DA和OPLS-DA分析圖Fig 3 Plots of PLS-DAand OPLS-DAanalysis

表1 脂類差異代謝物鑒定信息Tab 1 Lipid differential metabolites identification

4 討論

APAP誘導的急性肝損傷模型是常用的藥物性肝損傷模型，以過量APAP造模16 h后可出現明顯的ALT含量顯著升高，以及肝臟病理損傷[8]。課題前期對過量APAP造模后1 h的時間點進行了研究，此時ALT含量并未升高，也未出現明顯的病理改變，但肝組織中GSH含量顯著下降，而GSH是體內重要的抗氧化物質，也是APAP毒性代謝產物的關鍵解毒物質。該結果說明，APAP造模后1 h機體抗氧化能力顯著下降，APAP肝毒性已經啟動。在肝毒性的啟動階段，機體勢必通過發生一系列的變化逐步加重肝損傷。通過系統生物學手段可以揭示機體發生在組織改變之前的整體變化，是目前快速尋找生物標志物的常用手段[9]。目前，通過蛋白質組學的研究方法，Thulin P等[10]發現在轉氨酶升高之前，角蛋白18（K18）已經開始明顯上升，較ALT對肝損傷更為敏感。Antoine DJ等[11]發現高速泳動族蛋白1（HMG1）也可在轉氨酶升高之前明顯升高。此類生物標志物與傳統肝損傷標志物ALT相比，具有更快速、更敏感的特點，為DILI的早期診斷提供了新的可能。在代謝組學方面同樣有研究發現，DILI早期可出現明顯的代謝輪廓的改變，血漿的內源性代謝物會比血清生化參數對DILI的反應更為敏感[12]。肝臟是人體最大的代謝器官，參與大部分內、外源性物質的代謝，也是脂類代謝的主要場所，有研究認為脂質過氧化過程是導致DILI的重要原因之一[13]。本研究主要從脂類代謝的角度觀察機體在給予肝損傷劑量APAP之后的變化。本研究以APAP造模后1 h這個時間點，觀察小鼠血漿脂類代謝物的改變情況，以期發現與APAP造模相關的脂類差異代謝物，說明肝損傷的發生過程，并尋找有進一步研究價值的生物標志物，這可為藥物性肝損傷的早期診療提供一定的理論幫助。

表2 脂類差異代謝物的相對表達結果Tab 2 Relative expression results of lipid different metabolites

本研究發現，正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿代謝組的整體輪廓存在明顯差異，具有很好的區分度。共檢出了14個脂類差異代謝物，包括脂肪酰類、甘油磷脂類和鞘脂類。脂肪酰類包括5個差異代謝物。其中，9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸是一種亞油酸氧化產物，部分亞油酸可由脂氧合酶、環氧酶、P450酶催化或者通過非酶促作用發生氧化反應。在針對非酒精性脂肪肝炎患者的血清脂類質譜分析中發現，亞油酸氧化產物與肝組織病理（炎癥、纖維化、脂肪變性）密切相關。非酒精性脂肪肝炎患者亞油酸氧化產物較肝脂肪變性患者明顯增多[14]。亞油酸氧化產物可增強肝臟Kupffer細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達促進炎癥反應[15]。同時也可以增加過氧化物水平誘導肝細胞凋亡[16]。在本研究中，肝損傷劑量APAP給藥1 h后小鼠血漿中9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸水平明顯升高，這很可能是肝臟損傷的不利信號。十四烷二酸是一種C14α，ω-二羧酸，也是一種重要的脂肪酸氧化產物。在肝臟微粒體，脂肪酸的ω碳原子羥化生成ω-羧脂肪酸，再進一步生成α，ω-二羧酸，隨后進入線粒體發生β-氧化。同時二羧酸也是過氧化物酶體增殖劑激活受體的配體（PPARα），參與調解肝內的脂肪代謝過程。有研究發現，在急性酒精性肝炎的患者血清中，二羧酸包括十四烷二酸水平顯著升高[17]。在本研究中，過量APAP給藥后1 h，可以發現小鼠血漿中十四烷二酸水平顯著升高。

在14個脂類差異代謝物中，8個屬于甘油磷脂類。肝臟是血液中甘油磷脂的主要來源，甘油磷脂同樣是肝細胞以及線粒體膜的重要組成部分，PE（20∶3（8Z，11Z，14Z）/0 ∶0）、LysoPE（20 ∶4（8Z，11Z，14Z，17Z）/0 ∶0）、LysoPE（20 ∶3（5Z，8Z，11Z）/0 ∶0）、PE（20 ∶5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）/0 ∶0）、PE（18 ∶1（9Z）/0 ∶0）、LysoPE（18 ∶2（9Z，12Z）/0∶0）、PE（22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/0∶0）屬于溶血磷脂酰乙醇胺或溶血磷脂，通常由磷脂酶A催化降解磷脂得到，也可來源于甘油一酯的磷酸化作用或者甘油磷脂的酰化作用。在不同的肝臟疾病中，溶血磷脂的變化并不一致。例如，與肝硬化患者相比，LysoPEs在肝癌細胞中表達明顯增多[18]。在自身免疫性肝炎的早期研究中顯示，刀豆球蛋白A處理的小鼠LysoPEs明顯下調[19]，在本研究中，在APAP給藥1 h后，小鼠血漿中溶血磷脂水平與正常組比較明顯下降，與上述文獻報道結果一致。PS（MonoMe（11，5）/DiMe（13，5））是一種磷脂酰絲氨酸，也是細胞膜的重要組成成分。APAP處理1 h時，小鼠血漿中 PS（MonoMe（11，5）/DiMe（13，5））水平同樣明顯降低。膜磷脂水平降低，很可能反映了過量APAP對細胞膜或線粒體膜造成了影響。

將脂類差異代謝物水平與血漿中APAP水平進行相關性分析發現，9-硫雜硬脂酸、十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、Scyphostatin A和L-肉豆蔻酰基肉堿均與APAP水平顯著相關。

綜上所述，本研究探討了APAP肝損傷造模后1 h，轉氨酶和組織損傷尚未出現之前血漿脂類代謝組學的變化，篩選與早期肝損傷相關的脂類差異代謝物。結果發現，7個溶血磷脂水平下降，反映了肝損傷劑量APAP對細胞膜結構和功能可能有影響；同時發現，APAP致肝損傷后，小鼠血漿中十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸水平明顯升高，且與APAP水平顯著相關。該結果可為進一步的DILI機制研究及生物標志物研究提供理論支持。