小檗堿對PCOS大鼠子宮內膜PPARs的表達及內分泌代謝的影響

尹天曉 溫菁 魏巍

【摘要】 目的：探討小檗堿對多囊卵巢綜合征大鼠子宮內膜PPARs的表達及內分泌代謝的影響。方法：采用Poretsky造模法，對大鼠造模。造模后將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、羅格列酮組、小檗堿組，每組10只。采用灌胃的方法給藥，正常組及模型組給予生理鹽水，每日對大鼠行陰道涂片，瑞氏染色法觀察其動情周期，OGTT測其血糖變化，用ELISA檢測E2、FSH、LH、T、INS等指標，計算HOME-IR，取大鼠卵巢及子宮進行HE染色及免疫組化。結果：小檗堿可使子宮內膜PPARα、γ值升高，改善PCOS大鼠糖代謝異常，降低LH、T、INS水平，改善卵巢多囊樣表現及子宮腺肌癥樣表現。結論：小檗堿對子宮內膜PPARα、γ高表達，可恢復大鼠動情周期，改善卵巢激素變化及糖代謝和胰島素抵抗，且其療效優于羅格列酮。

【關鍵詞】 多囊卵巢綜合征; 小檗堿; 過氧化物酶體增殖物激活受體; 代謝

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Berberine on the expression and endocrine metabolism of PPARs of endometrium in rats with polycystic ovary syndrome.Method：Poretsky modeling method was used to model rats.Rats were randomly divided into the normal control group，model group，Rosiglitazone group and Berberine group，10 rats in each group.The normal group and the model group were given normal saline.Daily vaginal smear was performed on rats，and the estrus cycle was observed by rehman staining.The changes of blood glucose were measured by OGTT，E2，FSH，LH，T，INS and other indicators were detected by ELISA，and HOME-IR was calculated.HE staining and immunohistochemistry were performed in the ovary and uterus of rats.Result：Berberine could increase the PPARα，γ of endometrium，improve glucose metabolism abnormality in PCOS rats，decrease LH，T，INS level，improve the ovarian polycystic appearance and adenomyosis.Conclusion：Berberberine can cause high expression of PPARα，γ on endometrial ，restore emotional cycle，improve ovarian hormone changes，glucose metabolism and insulin resistance，and its effect is better than Rosiglitazone.

【Key words】 PCOS; BBR; PPARs; Metabolic

First-authors address：Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.001

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見的內分泌疾病，排卵障礙及異常的內分泌改變使子宮內膜分化不良，影響胚胎植入，導致低妊娠率和高流產率[1]。此外，還影響子宮內膜正常的周期性變化，導致子宮內膜可能有不同程度的增生，發展為子宮內膜癌的風險也增加[2]。常伴胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和肥胖[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一種核內受體轉錄因子，具有多種生物學效應。可增強機體對胰島素的敏感性，促進脂肪細胞分化和脂肪生成，調節體內糖平衡，抑制炎癥因子生成及炎癥反應。與胰島素抵抗有著密切的關系，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物（TZDs）的作用靶點[4]。近年研究發現PPARs在人類生殖系統中表達，且參與卵巢雌、孕激素的合成并影響受孕，通過影響組織的重塑方式調節卵泡的發生、排卵和黃體的發育，參與胚胎發育及調節胎盤功能、維持妊娠等[5]。

小檗堿（Berberine）是黃連的主要成分之一，在以往主要用于胃腸疾病。最新研究發現，BBR具有明顯的降糖、降血脂作用，可明顯降低2型糖尿病患者的血糖、血脂水平，改善胰島素抵抗[6-7]，療效肯定。同時發現BBR作為中藥單體是一種PPARα、β、γ泛激動劑[8]。研究發現PPARγ參與調節子宮的正常生理功能，調節類固醇激素的分泌，與胰島素抵抗相關[9]。但PPARα、β是否參與生殖功能的調節目前尚無相關研究，且PPARγ在子宮內的調節機制不清。為此本實驗應用BBR對PCOS大鼠模型進行治療，觀察其對PCOS大鼠子宮內膜PPARs及內分泌代謝的影響，為了解BBR對PPARs的調節提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人胰島素注射液（北京賽生藥業有限公司）;注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG，寧波人健藥業集團股份有限公司）;小檗堿（東北制藥）;羅格列酮（成都恒瑞制藥有限公司）;酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自上海朗頓生物技術有限公司;兔四步法檢測試劑盒（中杉金橋）;PPARα、β、γ抗體購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及造模 選用85日齡SD雌性大鼠40只隨機分為對照組（10只）和模型組（30只）。模型組第1～21天頸背部皮下注射INS 2.0 IU/d，生理鹽水稀釋至0.2 mL，1次/d。第11～21天，皮下注射hCG 3.0 IU/d，2次/d。以5%葡萄糖溶液替代日常飲水，正常組皮下注射生理鹽水0.2 mL/d及1%羥甲基纖維素水溶液0.5 mL灌胃1次，共計21 d，全部大鼠每周稱體重1次，每日進行陰道涂片檢查;陰道上皮細胞持續角化，提示無排卵表明大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后將模型組大鼠隨機分為模型對照組、羅格列酮組、小檗堿組，每組10只，每天分別給予0.9%生理鹽水5 mL、小檗堿300 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），羅格列酮200 mg/kg（溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）灌胃。每日行陰道涂片觀察各組大鼠動情周期變化，28 d后行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）測定大鼠各時間血糖值。

1.2.3 觀察內容及方法 動情周期：連續2個周期陰道脫落細胞涂片，瑞氏染色觀察大鼠動情周期。OGTT試驗：大鼠禁食、不禁水12 h，以3 g/kg劑量灌服50%葡萄糖溶液，尾尖取血，血糖儀測定大鼠灌糖后 0、60及120 min的血糖值。ELISA法檢測大鼠血清E2、INS、FSH、LH及T水平，HOMA-IR=空腹血漿胰島素（μU/mL）×空腹血漿葡萄糖（mmol/L）/22.5。HE染色及免疫組化觀察大鼠卵巢及子宮形態學變化：子宮組織免疫組化，計算子宮組織PPARs的變化。

1.3 統計學處理 使用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，符合正態分布計量資料多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗動物陰道涂片 （1）模型組：陰道涂片無周期變化。（2）正常組：陰道涂片呈周期性變化，發情前期（陰道上皮呈膨大橢圓扁平狀）-發情期（鱗狀上皮脫落，鏡下堆疊）-發情后期（大量白細胞，少量角化上皮）-靜止期（大部分白細胞，少量較小有核扁平上皮）周期變化。（3）小檗堿組及羅格列酮治療組：動情周期變化同正常對照組。見圖1。

2.2 各組實驗動物空腹FPG、FINS、HOME-IR激素水平比較 與對照組相比，模型組FINS升高（P=0.00<0.05）;與模型組相比，小檗堿組與羅格列酮組FINS降低（P=0.00<0.05），羅格列酮組與小檗堿組FINS比較，差異均無統計學意義（P=0.47>0.05）。對照組與模型組FPG比較，差異無統計學意義（P=0.20>0.05），與模型組相比小檗堿組與羅格列酮組FPG差異均無統計學意義，羅格列酮組與小檗堿組組FPG比較，差異無統計學意義（P=0.43>0.05）。與對照組相比，模型組HOME-IR升高（P=0.00<0.05），與模型組相比小檗堿組與羅格列酮組HOME-IR降低（P=0.00<0.05），與羅格列酮組相比小檗堿組HOME-IR降低（P=0.00<0.05）。見表1。

2.3 各組實驗動物空腹OGTT比較 與對照組相比，模型組OGTT第1、2小時血糖水平升高（P=0.01<0.05）;與模型組相比，小檗堿組、羅格列酮組OGTT第1、2小時血糖水平降低（P=0.00<0.05）;小檗堿組與羅格列酮組間比較，差異無統計學意義（P=0.43>0.05）。見表2。

2.4 各組實驗動物空腹血清激素水平比較 與對照組、小檗堿組及羅格列酮組相比，模型組LH、T明顯升高（P=0.00<0.05）;對照組與小檗堿組LH相比較，差異無統計學意義（P=0.43>0.05）。與對照組相比，其余三組FSH明顯升高（P=0.00<0.05），小檗堿組和羅格列酮組之間FSH比較差異無統計學意義（P=0.58>0.05）。與對照組相比，模型組E2降低，差異有統計學意義（P=0.04<0.05），小檗堿組和羅格列酮組T水平比較差異無統計學意義（P=0.16>0.05）。見表3。

2.5 HE染色結果 （1）模型組：卵巢組織鏡下見多個卵泡，呈不規則囊性擴張狀且囊狀范圍大，占整個標本1/3～1/2面積大小。囊內未見卵母細胞及間質腺，卵泡周圍顆粒細胞層數減少，從1到3層分布不等，顆粒細胞數量也隨之降低，正常發育的卵泡減少，子宮組織間腺體增加。（2）羅格列酮及小檗堿治療組：卵巢未見明顯卵泡囊性擴張，鏡下可見多個各階段卵泡，呈從小到大分布。卵泡周圍顆粒細胞逐層分布，顆粒細胞層數4～7層不等，可見卵丘不規則分布于卵泡中，子宮形態基本正常。見圖2、3。

2.6 免疫組化結果 （1）與對照組相比模型組PPARα表達下降（P=0.00<0.05），與羅格列酮組和模型組相比小檗堿組PPARα升高（P=0.00<0.05），與模型組相比羅格列酮組PPARα升高（P=0.00<0.05）;（2）PPARβ在各組間比較差異均無統計學意義（P=0.61>0.05）;（3）與對照組相比模型組PPARγ表達下降（P=0.00<0.05），與模型組相比小檗堿組、羅格列酮組PPARγ升高（P=0.00<0.05），與羅格列酮組相比小檗堿組PPARγ升高（P=0.04<0.05）。見表4、圖4～6。

3 討論

3.1 小檗堿對子宮內膜PPARs的表達 PPARs在動物體內有著廣泛的生物學作用，可調節脂類代謝、能量收支平衡以及細胞分裂分化等重要生理過程。目前對PPARγ的研究較多，其激動劑如TZDs可以增加胰島素敏感性并降低血糖，同時促進脂類存儲和脂肪形成。在2型糖尿病動物模型中，有效的選擇性的PPARγ激動劑可以改善IR并降低其血糖[10-11]。BBR為PPARs的泛激動劑，可以通過調節PPARs的表達，達到治療PCOS的目的。羅格列酮為TZDs類藥物，有研究認為是PPARγ的單激動劑，其臨床應用副作用較大。本實驗結果顯示，BBR及羅格列酮對子宮內膜PPARα、γ的表達均高于模型組，PPARβ表達與模型組無明顯差異，說明BBR和羅格列酮均可使子宮內膜PPARα、γ呈現高表達。

3.2 小檗堿對生殖內分泌與代謝的影響 BBR是從傳統中藥黃連根莖中提取的異喹啉類生物堿。近年來研究表明，BBR除具有傳統胃腸藥的作用外，還能夠改善IR，降低血糖、血脂，增加胰島素敏感性而用于2型糖尿病的治療，且無明顯不良反應[6-7]。BBR的作用特點和羅格列酮類似，屬胰島素增敏劑，臨床可用于糖耐量異常和輕度高血糖患者[12]，相關實驗研究表明BBR可明顯改善糖尿病患者的IR情況[13]，并且筆者前期通過臨床試驗，比較BBR及二甲雙胍對PCOS患者的療效，BBR的效果顯著，并且副作用小[14]。有研究發現BBR能改善PCOS患者的向心性肥胖，調節血脂，減輕體重，改善慢性炎癥[15-16]。本研究結果顯示，BBR較好的改善大鼠IR，調節糖耐量異常，恢復其動情周期，改善卵巢多囊狀態及子宮腺肌癥樣表現的作用。

3.3 胰島素抵抗與PPARs的相關性 PPARs與胰島素抵抗有著密切的關系，是胰島素增敏劑的作用靶點。噻唑烷二酮類可通過激活胰島素受體亞單位上的酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，從而改善IR，降低胰島素水平，提高PCOS患者排卵率，改善月經紊亂，增加妊娠機會[17]。目前，基于PPARs結構設計治療胰島素抵抗的西藥主要是噻唑烷二酮類，但可引起肥胖、水腫，少量肝毒性等不良反應[18]，不能大量及長期用于臨床。近年來，研究發現很多中藥活性成分可以激活PPARs靶點，從而改善IR[19-20]，降低PPARγ單激動劑的副作用。本次實驗顯示，BBR可以通過調節PPARα、γ的表達，改善IR，進而改善大鼠的生殖功能。BBR治療后，陰道涂片發現大鼠恢復了其規律的動情周期，高LH水平亦有明顯降低，黃體數目增多，各級卵泡數目增多，子宮腺肌癥樣表現明顯改善，大鼠整體內分泌功能趨于正常，進而使卵巢及子宮形態學趨于正常，使大鼠恢復規律的動情周期及排卵。BBR組與羅格列酮組相比INS和HOME-IR降低（P<0.05），說明BBR在改善IR的作用上優于羅格列酮。

綜上所述，BBR可使子宮內膜PPARα、γ高表達，改善PCOS大鼠內分泌代謝異常，降低T及LH水平，改善大鼠內分泌失調狀態及卵巢和子宮形態學結構，在改善IR方面優于羅格列酮。但其是通過哪種途徑和機制調節PPARα、γ的仍需進一步研究。

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（收稿日期：2018-09-11） ?（本文編輯：周亞杰）