一株酒曲核心酵母的鑒定及產乙酸乙酯條件優(yōu)化

范三紅，馬紅玉，王朝陽，張錦華

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

我國白酒釀造具有悠久的歷史，釀酒與酒曲中微生物的代謝密不可分，酒曲中存在著復雜的微生物系統，它們的代謝作用是白酒風味物質的主要來源。釀酒過程中，乙酸乙酯主要來源于微生物的代謝作用，包括酵母和細菌，其中，生香酵母是產生風味物質的優(yōu)勢菌種，可以利用多種有機物為原料合成酯類物質，代謝為原酒中的香氣成分[1-3]。白酒的香型和香氣等品質，一般取決于含有酯類物質的種類和濃度。乙酸乙酯是清香型白酒主體香氣的組成成分[4]，并且在酯類物質中起著主導作用，其含量的高低還決定著酒的品質。較多對乙酸乙酯發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗的報道中發(fā)現，選擇溫度、發(fā)酵pH、酒精度、搖瓶轉速和稻殼麩皮等谷物的添加量為試驗因素，乙酸乙酯含量在原酒中可達1～4 g/L[5-8]。因此，提高乙酸乙酯的含量，對于提高白酒原酒的質量具有重要意義。

本研究對酒曲中一株可產香氣成分的核心酵母進行了鑒定，并對其產乙酸乙酯條件進行了優(yōu)化，旨在為白酒風味的改善及品質的提升提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 供試酒曲核心酵母W-2 由山西省祁縣某酒廠提供。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、乙醇、乙酸乙酯等均為分析純；酵母DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒（Omega Bio-Tek，中國技術支持中心），引物ITS4，ITS5，6×Loading Buffer，蛋白酶K，溶菌酶瓊脂糖G-10，I 型核酸染色（上海生物工程生物技術有限公司），Marker（λ DNA/hand III，用于酵母基因組凝膠電泳），100 bp DNA Marker（用于PCR 產物凝膠電泳），2×Taq PCR Mastermix（北京Real-times 生物科技有限公司）等。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3.2 液體YPD 培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器與設備 電子天平JA1203N，上海恒平有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床HRHPY-300，青島海爾特種冰箱柜有限公司；雙定時電泳凝膠儀DYY-6C，北京六一生物科技有限公司；旋渦振蕩儀DY-8C，蘇州凈化設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海Boxun 工貿有限公司；PCR 熱循環(huán)儀BIO RAD TIOOTM，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；低速離心機SC-3614 ZONKIA，安徽中科Zonkia 科學儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱LDX-75KB，北京市六一儀器廠；電熱鼓風干燥箱101-2AB，余姚市東方電工儀器廠；電熱恒溫水浴鍋、通用電爐，天津市大港區(qū)紅杉實驗設備廠；超潔凈工作臺，AIR TECH Sujing Group Antai Company；全能成像分析系統BioRad，哈爾濱德遠科技開發(fā)有限公司；氣相色譜儀-2010 ATF，230 V，Shimadzu Corporation 日本島津公司。

1.2 試驗方法

由上述觀點，建構主義與人本主義主張以學生為主體，教師是知識的促進者和主導者。這種觀點與任務驅動教學法所蘊含的教學理念相符合，為其實施提供了堅實的理論依據。

1.2.1 菌株的形態(tài)學分析 用三區(qū)劃線法將純化后的W-2 菌株接種到PDA 平板培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置并靜置培養(yǎng)，約3 d 時菌種生長狀態(tài)良好，觀察此時菌種生態(tài)學特征[8-9]。

1.2.2 W-2 菌種的分子生物學鑒定 挑取平板上生長狀態(tài)良好的W-2 菌株接種到YPD 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min 恒溫搖床中培養(yǎng)20 h，制備菌種種子液，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)期間對培養(yǎng)液600 nm 處的OD 值進行測定，當OD 值達到約1 h 時，用酵母DNA 試劑盒提取基因組，再用0.7%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳（樣品，5 μL；Marker，λDNA/handIII，5 μL；6×Loading buffer，2 μL）。膠回收后，以此基因組作為模板進行聚合酶鏈式反應（25 μL 體系：引物為ITS4：5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′，5 μL；ITS5：5′-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3′，5 μL；dNTP，Taq DNA聚合酶的混合物和緩沖液，12.5 μL；超純水，2.5 μL；模板，1 μL）。PCR 反應條件（體系25 μL）：起始105 ℃；94 ℃保持5 min，94 ℃保持30 s，55 ℃保持30 s，72 ℃保持1.5 min，34 次重復；72 ℃保持10 min。PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳（樣品為PCR 產物，5 μL；100 bp DNA Marker，5 μL）進行測試。使用全能成像分析系統對凝膠進行成像分析記錄，并對PCR 產物進行測序，求取反向序列，保留測序結果中可靠的序列，通過NCBI 進行比較，獲得具有更高同源性的已知分類群，然后選取并使用這些序列通過MEGA 5.0 分析軟件構建系統發(fā)育樹[7，10-11]。

1.2.3 W-2 菌株產乙酸乙酯條件單因素試驗 保證發(fā)酵條件中其他因素穩(wěn)定，改變其中一個因素，發(fā)酵結束后，測定體系中乙酸乙酯和乙醇的產量。考察該因素對菌株產乙酸乙酯的影響，具體因素和變量及發(fā)酵條件如下[12]。

1.2.3.1 接種量 分別以2%，4%，6%，8%，10%的比例將剛進入穩(wěn)定期的種子液接種至50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵3 d，發(fā)酵溫度控制在28 ℃，培養(yǎng)基pH 值為7、含糖量40 g/L。

1.2.3.2 發(fā)酵時間 取4%菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下分別發(fā)酵1，2，3，4，5 d，培養(yǎng)基pH 值為7、含糖量40 g/L。

1.2.3.3 培養(yǎng)基含糖量 取4%菌種接入含糖量分別為30，35，40，45，50 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵2 d，發(fā)酵溫度為28 ℃，培養(yǎng)基pH 值為7。

將所有菌株的OD 值調整為相同值，吸取菌懸液接種到含有50 mL YPD 培養(yǎng)基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)時間到達時取出，加入100 mL 40%乙醇溶液并進行蒸餾，收集等量的濾液50 mL，濾液通過0.22 μm 濾膜，通過氣相色譜檢測[7]。

1.2.4 響應面法優(yōu)化菌株W-2 的發(fā)酵條件 運用Design-Expert 8.05 軟件，以單因素試驗結果中的因素關鍵點為基礎，挑選培養(yǎng)基含糖量（X1）、發(fā)酵時間（X2）和接種量（X3）為自變量，以發(fā)酵液中可產生的乙酸乙酯濃度為響應值進行設計，于Box-Behnken方法下設計3 水平試驗方案，并對優(yōu)化出的17 種實驗方案進行試驗[15-19]。

2 結果與分析

2.1 W-2 菌株的形態(tài)學特征

由圖1 可知，菌種W-2 菌落為直徑1 mm 左右乳白色菌落，圓形，不透明，光滑，邊緣整齊，液體培養(yǎng)有膜，水果香氣，菌體量大時連片生長，菌落表面濕潤，生長后期表面變干，膏狀柔軟，易于挑取。查詢菌種鑒定手冊并對比特征，可確定W-2 具有典型的酵母特征。

2.2 菌株W-2 的分子學鑒定

在對所提取的酵母基因組進行純化回收后，將此基因組進行PCR 擴增，結果如圖2 所示，與Marker、對照酵母相對比，菌株W-2 條帶處于約600 bp 處，清晰明亮且易分辨。

將PCR 擴增產物送往上海生工成都分公司進行測序，測序結果為：CGGGCTGTCTACCTGATTTG AGGTCAACTTTTAGTTTATTGTTGTTAAGCCGAGC CTAAAATACTTCTAAACCTGCCTAGCTGATATAAC GAGTTGGAAGAACCTAATACATTATTTCAGAAAG ACTGCTTATTAGTACACTCTTGCTAAGTCAATATT TCAAGTTAACCCTTGACAGAGTATCACTCAATACC AAACCCGAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAA ACAGGCATACCCTCTGGAATACCAGAGGGTGCAA TGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCT GCAATTCACAATACGTATCGCATTTCGCTGCGTTC TTCATCGTTGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTTTGAAGATTTTAATTTTTGTTAAAAATTTT CATGACTATTGGTTAAAGGTTTTAACATTAAAAAA TGTGTTTAGACCTTTGGGCACGCAGCTAGGCTGAT GCACCCAAAGCAAAGTTCAAAAAAACTAGACAA TGTGTGTAAGGTTTATCGCCGCGCAATTAAGCGCT GGCAATAGAATACTATAATGATCCTTCCGCAGGT TCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTAACCTT CCCC。

求取反向序列，并在NCBI 上將其與基因庫中的序列進行Blast 比對，結果顯示，W-2 菌株與Wickerhamomyces anomalus（KY105881.1）的同源性最高，如圖3 所示。利用軟件MEGA 5.0 將W-2 與所挑選的相似序列構建系統發(fā)育樹，結果如圖4 所示，可確定W-2 為異常威克漢遜酵母。

2.3 菌株W-2 發(fā)酵產乙酸乙酯的單因素試驗

2.3.1 接種量對乙酸乙酯產量的影響 發(fā)酵結果中乙酸乙酯的濃度隨著接種量的變化趨勢如圖5所示，呈先升高后降低，接種量較少時培養(yǎng)液可以產生乙酸乙酯的菌體較少，乙酸乙酯的產量較低，隨接入菌體數量的增加，乙酸乙酯的產量有所增加，但培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質等菌種的生存條件是有限的，當菌體接入到達一定數量，菌體便由于營養(yǎng)物質不足及產生不利生存的代謝物等原因而保持數量平衡甚至負增長，此時乙酸乙酯的產量便有所下降；當接菌量為4%時，乙酸乙酯的產量最高，為0.379 mg/mL。

2.3.2 含糖量對乙酸乙酯產量的影響 培養(yǎng)基中糖量對乙酸乙酯產量的影響見圖6，葡萄糖是菌體生長的關鍵營養(yǎng)物質，糖濃度比較低時，養(yǎng)分不足以提供太多菌體的生長，此時乙酸乙酯的生產受到限制，隨著糖濃度增加，提供更多菌體生長的碳源，乙酸乙酯產量隨之增加，當糖濃度過高時，由于滲透作用，細胞生長受到抑制，因此乙酸乙酯產量降低。其中，當培養(yǎng)基的含糖量為40 g/L 時，乙酸乙酯產量最高，為0.619 mg/mL。

2.3.3 培養(yǎng)時間對乙酸乙酯產量的影響 發(fā)酵過程中乙酸乙酯產量隨培養(yǎng)時間變化呈先增加后降低、最后趨于穩(wěn)定的變化（圖7），隨著培養(yǎng)時間的增長，菌種生長繁殖迅速，代謝速率快，在第2 天乙酸乙酯達最大值（0.448 mg/mL）；隨后其產量反而下降，推測可能是由于被自身微生物生長所代謝。

對單因素試驗結果進行分析，選取合適的因素區(qū)間，利用響應面法設計優(yōu)化乙酸乙酯產生條件，進行3 因素3 水平（表1）響應面試驗設計（表2）。

表1 因素水平設計

對表2 進行二次線性回歸擬合，得到模型Y＝0.680＋0.050X1＋0.051X2-4.625E-003X3＋5.750E-003 X1X2＋2.500E-004 X1X3-0.19X12-0.14 X22-0.037X32，對其進行統計分析，其結果列于表3。

從表3 可以看出，自變量含糖量（X1）、發(fā)酵時間（X2）表現為顯著，二次項表現為極顯著，交互作用不明顯，線性關系顯著，其中，發(fā)酵時間對乙酸乙酯產量的影響最為明顯，其次為培養(yǎng)基中含糖量的多少。F 值越大表明越重要，因素的影響程度大小排序為X2＞X1＞X3，而失擬項是0.452 0，不顯著，證明此響應面分析的效果較好，并且R2＝0.989 8，模型的相關系數較高，R2adj＝0.976 6，說明該模型可以 對各條件下乙酸乙酯產量的結果進行預測。

表2 菌株W-2 試驗設計及結果

表3 分析統計結果

2.4 響應面分析與優(yōu)化結果

如圖8～10 所示，各因素曲面的陡峭程度相比較，接菌量最平緩，含糖量居中，發(fā)酵時間最陡峭；而等高線相比較，發(fā)酵時間最密集，接菌量最稀疏，因此，幾種發(fā)酵條件中對響應值的影響力大小順序為X2＞X1＞X3，即發(fā)酵時間＞含糖量＞接種量。一階偏導結果為0，得到條件X1＝40.67，X2＝2.184，X3＝3.878%，響應值Y＝0.685 mg/mL。因此，得到預測乙酸乙酯最佳發(fā)酵條件參數為：含糖量40.67 g/L、發(fā)酵時間2.184 d、接種量3.878%。

2.5 發(fā)酵條件驗證試驗

按照響應面分析得到的最佳發(fā)酵條件為試驗方案，試驗條件為發(fā)酵時間2.184 d、含糖量40.67 g/L、接種量3.878%；考慮到實際的可操作性，修正條件為發(fā)酵時間2 d、含糖量41 g/L，接種量4%，在此條件下，發(fā)酵結束后測定乙酸乙酯平均產量為（0.696±0.047）mg/mL，相對標準偏差為4.1%，結果和預測值比較接近，較優(yōu)化前乙酸乙酯產量提高約20%。可見，此響應面預測模型有一定可行性。

3 結論與討論

本試驗用分子生物學方法對一株產乙酸乙酯較高的未知酵母W-2 進行鑒定，結果確認其為異常威克漢遜酵母，并用響應面法對其產乙酸乙酯的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，得到優(yōu)化條件為發(fā)酵時間40.67 d、含糖量2.184 g/L、接種量3.878%時，在此條件下菌株發(fā)酵產生的乙酸乙酯的產量為（0.696±0.047）mg/mL，為該酵母運用于酒曲中生產高質量白酒提供了理論基礎。由于此菌種自身產乙酸乙酯能力的局限性，并且本研究采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種測定目的酵母的酯化能力，與文獻中所報道的谷物作能源物質培養(yǎng)高產乙酸乙酯菌株的產酯能力具有一定差距。黃光建等[20]通過溫度、pH、發(fā)酵底物等因素優(yōu)化酵母產酯條件試驗得到的乙酸乙酯最高產量高達8.05 mg/mL；侯建光等[14]以稻殼為底物進行發(fā)酵，結果表明，乙酸乙酯產量高達13.03 g/kg。對本酵母菌的后續(xù)試驗可以從酵母的培養(yǎng)環(huán)境如培養(yǎng)基選擇多種原料或者從基因工程角度，對菌種進行誘變來篩選新型高產菌株。