響應面法優化野菊花黃酮脂質體的制備工藝

程鵬飛

（大理農林職業技術學院，云南大理 671003）

野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降血壓、清除氧自由基、增加冠脈血流量、抗動脈粥樣硬化、抗凝血、鎮痛、抗腫瘤等作用，不僅被用于風熱感冒、肺炎、口瘡、癰疽等疾病的治療，而且在治療心血管疾病、腦供血不足、早期神經退行性病變和調節血脂水平等方面也有良好的療效，在中獸醫療法中也被廣泛應用[1]。野菊花化學成分復雜，其品質和制劑品質的評定沒有統一的標準，過量服用野菊花也會有一定的毒副作用，黃酮類化合物是野菊花的主要藥效成分[2]，將野菊花黃酮制備成脂質體不僅可以提高療效，降低其毒副作用，還可以較好的控制脂質體制劑的質量和藥用劑量[3]。因此，野菊花黃酮脂質體有很好的研究價值和應用前景。

1 試劑與儀器

1.1 藥材與試劑

野菊花：購于楊凌華仁堂大藥房；蘆丁標準品（批號100080-200707），中國藥品生物制品檢定所；大豆磷脂（批號20140304），上海太偉藥業有限公司；膽固醇（批號F20140312），國藥集團化學試劑有限公司；魚精蛋白（批號20140930-1020A022）Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

PL-2002型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-3802H紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；TGL-16S型臺式高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；BSA224S-CW型電子天平等。

2 方法

2.1 野菊花黃酮提取、分離和純化

采用乙醇回流法提取，聚酰胺樹脂分離和純化[1]；制備了3批黃酮樣品，置于-20℃冰箱儲存備用。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 蘆丁標準液的配置

精密稱取干燥至質量恒定的蘆丁標準品24.4mg，加適量60%乙醇充分溶解，轉入100 ml的容量瓶中，用60%乙醇定容，即配置成0.244mg/ml的蘆丁標準液。

2.2.2 標準曲線的制作

準確稱取1.3334g的 AlCl3，用適量60%乙醇溶解，并定容至100ml，即配置成0.1mol/L的AlCl3溶液。分別精密量取蘆丁標準液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml于25ml的容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再用60%的乙醇定容，搖勻，靜置20min；以不加蘆丁標準液為空白最照，在波長415nm處測定吸光度值[1]，并繪制標準曲線。將所得吸光度的值與濃度的關系列于表1。

表1 蘆丁標準液濃度與吸光度值

得蘆丁標準曲線回歸方程為：Y=31.455X-0.0093，R2=0.9991（圖1），式中Y為溶液在415nm處的吸光度，X為蘆丁標準液的濃度。

圖1 蘆丁標準液的吸光曲線

2.2.3 樣品黃酮含量測定

分別于3批樣品中取樣0.0046g、0.0052g、0.0081g，用適量60%乙醇充分溶解，置于25 ml容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再加60%乙醇溶液定容，測量吸光度值，并帶入曲線計算得到3批樣品黃酮含量分別為10.9%、10.4%、11.2%。樣品平均黃酮含量為10.83%。

2.3 野菊花黃酮脂質體制備試驗

2.3.1 BBD響應曲面設計

脂藥比、膜材比、超聲時間是野菊花黃酮脂質體包封率的主要影響因素，以此3個因素為自變量，每個因素選擇3個水平（如表2），以脂質體包封率為指標。

表2 野菊花黃酮脂質體制備工藝響應面試驗設計因素及水平

采用響應面軟件（Design-Expert 7.1.6）中的Box-Behnken Design設計試驗，并進行試驗，計算出每一組試驗中脂質體的包封率，并用該軟件對試驗結果進行分析，篩選出最佳的制備條件組合。試驗設計及結果見表3。

2.3.2 野菊花黃酮脂質體的制備

采用薄膜分散法[4]結合超聲輔助法，按試驗設計分別稱取卵磷脂、膽固醇和野菊花黃酮樣品粉末，用10ml無水乙醇和10ml氯仿充分溶解，然后減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，在燒瓶內壁形成薄膜，加入PBS液20ml，繼續旋轉至膜完全溶解，按試驗設計時間進行超聲處理，再分別過0.45μm和 0.22μm的微孔濾膜，即制成野菊花黃酮脂質體。

2.3.3 脂質體包封率的測定

吸取野菊花黃酮脂質體0.5ml于1ml錐形離心管中，加入0.5ml魚精蛋白（10mg/ml）混勻，過夜，在4℃下，13000rpmin離心25min，吸取上清液于25ml的容量瓶中，加入0.1mol/L的AlCl3溶液1ml，再用60%乙醇溶液定容，按上述蘆丁標準法測定其吸光度，并代入標準回歸方程計算得黃酮含量，即游離藥物量[4]。脂質體包封率按照下列公式計算：

η=（C總-C游）/C總×100%

式中：η為脂質體包封率；C總為脂質體懸液中包封黃酮量與游離黃酮量之和；C游為游離黃酮含量。

3 結果與分析

3.1 試驗結果

試驗結果見表3，對結果進行響應面分析，經過二次回歸擬合，得到野菊花黃酮脂質體的包封率對脂藥比（A）、膜材比（B）、超聲時間（C）的二次多項回歸方程為：

Y=76.32-5.50A+8.16B-2.31C+4.58AB-1.72AC+2.70BC-8.94A2-20.91B2-5.61C2

表3 Box-Behnken試驗設計及結果

利用該軟件對結果進行多元線性回歸擬合，并對模型進行方差分析，結果見表4，模型P=0.0005＜0.01，表示模型極顯著，說明該模型成立，本實驗方法可靠。失擬項P=0.7092＞0.05，不顯著，表明該回歸方程擬合度較好，沒有失擬因素存在。進一步說明在試驗范圍內可以用來解釋和預測試驗結果。模型中的B、A2、B2對野菊花黃酮脂質體包封率的影響極顯著，A、AC、C2對野菊花黃酮脂質體包封率的影響顯著，同時結合F值的大小，可以知道B（膜材）比對野菊花黃酮脂質體包封率影響最大，其次是A（脂藥比），即膜材比＞脂藥比＞超聲處理時間。

表4 響應面方差分析

3.2 響應面工藝優化分析

利用 Box-Behnken模塊可以做出以兩兩自變量為坐標軸的3D圖和等高線圖（圖2、圖3，以脂藥比和膜材比為例，固定水平為超聲時間20min，A為脂藥比，B為膜材比，R1為包封率），這些圖不僅可以很好地揭示每個自變量對因變量的影響程度，也能直觀地反映自變量之間的交互作用。

圖2 脂藥比和膜材比響應曲面

圖3 脂藥比和膜材比等高線圖

通過該軟件模型對野菊花黃酮脂質體的制備條件進行優化，最優條件為脂藥比9.49：1，膜材比8.32：1，超聲處理時間18.71min。為了操作方便，將最優條件調整為脂藥比9.5：1，膜材比8.0：1，超聲處理時間19min。在此條件下制備的野菊花黃酮脂質體包封率為77.82%。通過3組試驗驗證，分別測得包封率為77.69%、76.98%和76.86%，重現性較好。

4 結論

目前制備野菊花黃酮脂質體的方法主要有薄膜分散法、乙醇注入法和超聲法等，本試驗采用薄膜分散法結合超聲輔助法，來制備野菊花黃酮脂質體。與乙醇注入法相比，薄膜分散法結合超聲處理制備得到的脂質體粒徑均勻，多為單室脂質體[1]。但是，薄膜分散法在減壓蒸發，形成薄膜的終點難以確定，有機溶劑蒸發速度過快等，都將導致制成的脂質體粒徑不均一，包封率低。正交試驗雖然能處理離散的水平值，并且能精確到某一個具體的點，但其無法找出整個范圍內因素的最優值及最佳組合條件[5]，響應面法克服了此缺點。采用響應面法，通過對影響因素的等高線圖、3D圖和多元線性回歸擬合，并對模型進行方差分析，綜合得出每一個因素對野菊花黃酮脂質體包封率影響的顯著性水平，以及最佳值和最佳條件組合。

采用薄膜分散法結合超聲輔助法制備野菊花黃酮脂質體，并用Design-Expert（7.1.6）軟件分析優化制備條件，得到最佳條件為脂藥比9.5：1、膜材比8：1、超聲處理時間19 min，在此條件下制備的野菊花黃酮脂質體包封率為77.82%，重現性較好。