復方中藥對感染森林腦炎病毒小鼠血液炎性因子的影響及相關性分析

張瑜

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

森林腦炎是由森林腦炎病毒所致的中樞神經系統急性傳染病，當致病力很強或大量的森林腦炎病毒侵入機體并通過血腦屏障侵入腦組織時，就會引發腦內的固有免疫細胞，特別是小膠質細胞激活而發生強烈的神經炎癥反應，小膠質細胞激活后會通過釋放大量具有神經毒性的炎癥因子，如腫瘤壞死因子、白介素、前列腺素、一氧化氮等造成神經損傷，即免疫介導的神經炎癥反應引起的腦組織繼發性損害，對腦組織造成更大的傷害[1-3]。目前，森林腦炎的治療藥物主要有地塞米松、利巴韋林和干擾素等，這些藥物雖都有抗菌消炎的作用，但如果長期、大劑量應用，則會引起各種不良反應和停藥反應[4]。因此，本實驗依據我國傳統醫學臨床經驗和現代醫學研究成果，以具有抗病原微生物、抗炎、抗過敏的苦參為主藥，輔以具有鎮痛、保護神經和調節免疫功能的訶子、川楝子、梔子、紫花地丁對感染森林腦炎病毒的小鼠進行治療，對其血清中炎性因子的含量進行測定，并對炎性因子與上游蛋白的相關性進行分析，以期為復方中藥森林腦炎的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病毒液的制作和收集

將森林腦炎病毒液加入地鼠腎傳代細胞培養瓶中，加入病毒液后慢慢晃動混勻，保證病毒液充分接觸并感染細胞后，培養瓶37 ℃培養90 min。每天觀察細胞，當超過90%細胞病變并有細胞脫落時收獲細胞病毒液，然后反復在-80℃、-37℃條件下反復凍融細胞，充分釋放病毒于細胞培養液中，無菌條件下1 000 rpm，離心10 min，收集上清液，分裝備用。

1.1.2 感染小鼠模型的制作

選取清潔級21日齡雄性小鼠，體質量(18±1)g，制作模型前禁食12 h，禁水6 h。將小鼠麻醉后，在小鼠眼后角、耳前緣、顱中線所構成的三角形中點部位，將微量注射器抽取好的病毒懸液20 μL垂直進針3～5 mm，將病毒液緩慢推進鼠腦，注毒結束后待病毒液完全吸收后再快速將針頭拔出，以免未被腦組織完全吸收的病毒液流出。采用RT-PCR技術檢測實驗小鼠血清中森林腦炎病毒的RNA片段，以鑒定動物模型制作的成功。

1.1.3 復合中藥

苦參、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁5味藥材飲片由黑龍江中醫藥大學提供，經50℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉。苦參、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁原粉按4∶2∶2∶2∶1的比例組方，加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取過濾后藥汁混合，濃縮使1 mL的藥液相當于1 g的藥粉，制成實驗藥液。

1.2 實驗設計與分組

選取12只健康小鼠作為空白組，另選取60只模型小鼠隨機分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和陽性藥(地塞米松)組，每組12只。各組具體處理方法見表1。

動物飼養于人工控制條件下，小鼠同室、分籠飼養，每籠6只。室溫控制在20℃～23℃，相對濕度為50%～60%，每12 h光照/黑暗循環，小鼠可自由進食、進水，保持墊料清潔干燥，實驗期為7天。

表1 各組大鼠處理情況

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 樣本采集

在實驗第4天和7天，每組選擇5只小鼠麻醉后，用毛細管于眼球后靜脈叢采集血液1 mL于內壁涂有肝素的離心管中，并將標本在采集后的30 min內于4 ℃條件下3 000 rpm離心15 min后取上清液，置于-80℃低溫冰箱保存，以檢測血清中相應的指標。

1.3.2 檢測指標與方法

實驗采用酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠第4天、7天腦組織和血清中TLR-2、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，試劑盒均購自上海聯邁生物工程公司，實驗方法按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學處理

實驗結果使用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，所有數據均采用平均數±標準差的形式表示，組間數據比較采用one-way ANOVA單因素方差分析，以P≤0.05表示差異顯著。

2 實驗結果

2.1 小鼠血清中炎性因子的分析

小鼠血液中炎性因子的檢測結果見表2。在實驗第4天和7天，模型組和各治療組小鼠血清中的TLR-2水平顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4天和7天，模型組、陽性藥組、低劑量組小鼠血清中的TLR-2濃度顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

在實驗第4天和7天，模型組和各治療組小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著高于空白組(P<0.05)；在實驗第4天和7天，模型組、低劑量組小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著高于陽性藥組和中、高劑量組(P<0.05)。

表2 復方中藥對各組小鼠血清中炎性因子含量的影響

注：與空白組比較,*P<0.05;與中劑量組比較,△P<0.05;與高劑量組比較,#P<0.05;與陽性藥組比較,▲P<0.05。

2.2 小鼠血清中各炎性因子相關性分析

2.2.1 小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關性分析

小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關性結果分析見圖1。如圖1所示，實驗第4天，IL-1β與TLR-2相關性的回歸方程式為Y=0.354X-2.950，r=0.962，二者正相關；實驗第7天，IL-1β與TLR-2相關性的回歸方程式為Y=0.239X+1.163，r=0.848，二者正相關。結果見圖1。

圖1 小鼠血清中IL-1β與TLR-2相關性分析

2.2.2 小鼠血清中IL-6與TLR-2相關性分析

小鼠血清中IL-6與TLR-2相關性分析結果見圖2。如圖2所示，實驗第4天，IL-6與TLR-2相關性回歸方程式為Y=0.954X-0.929，r=0.965，二者正相關；實驗第7天，IL-6與TLR-2相關性回歸方程式為Y=0.683X+9.021，r=0.874，二者正相關。結果見圖2。

2.2.3 小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關性分析

小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關性分析結果見圖3。如圖3所示，實驗第4天，TNF-α與TLR-2相關性回歸方程式為Y=3.398X-28.620，r=0.962，二者正相關；實驗第7天，TNF-α與TLR-2相關性回歸方程式：Y=2.122X+15.350，r=0.875，二者正相關。結果見圖3。

圖2 小鼠血清中IL-6與TLR-2相關性分析

圖3 小鼠血清中TNF-α與TLR-2相關性分析

3 討論

本實驗所采用的組方以苦參為君藥，其主效成分苦參堿具有抵抗多種病原微生物的作用，而且對炎癥也有明顯的抑制作用。梔子中的苷類和酸類物質具有消炎作用，訶子具有抗氧化的作用，而川楝子和紫花地丁具有抗菌作用。傳統醫學認為，該5味中藥組方具有抗菌、消炎、清熱、涼血之功效。

免疫反應是動物機體的一種自我保護的行為，是抵抗外源性的致病因子的感染和侵襲，是用來排除異己的自我防護機制[5]。免疫反應分特異性免疫反應和非特異性免疫反應，通常來說，抗原-抗體的反應體系均為特異性的免疫反應，這主要包括B淋巴細胞和T淋巴細胞的參與；而其他種類如巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞，則主要介導非異性免疫應答。特異性免疫反應和非特異性免疫反應是構成機體天然的防御體系之一[6]。一般情況下，人體在受到的感染比較輕微時，機體自身適度的免疫反應確實能夠幫助清除入侵到體內的病原體，這種情況下并不會發生典型的免疫反應，反而對機體正常組織的保護是有利的。但是，當病原體的致病力較強或對體內的侵襲規模過大時，機體便會調動更多的免疫反應防御體系對 “入侵”予以“反抗”，這種情況下就極其容易發生過度的免疫反應，導致與免疫相關的炎癥因子、趨化因子和活化的免疫細胞大量聚集到機體的被感染區，共同“抵抗”外源病原體的入侵，這種“反抗”的升級不僅不會保護體的正常組織，反而會造成感染區的器官組織遭受更大的破壞，對機體自身產生傷害，這就是局部的炎癥反應[7]。因此，在臨床研究時，也可以通過測定這些比較常見的炎性因子來判斷機體是否出現了過度的局部炎癥反應。

研究表明，IL-1β、IL-6 和TNF-α是比較常見的炎性因子。IL-1β存在于腦內的廣泛區域，通常情況下，IL-1β在中樞神經系統內的表達比較低，而當機體整體或中樞神經系統的局部發生損傷和感染時，會出現IL-1β的表達顯著提高。而IL-6是趨化因子家族的一類細胞因子，在腦中會對中樞神經系統發揮保護和毒性的雙重作用。在正常的腦組織中，IL-6表達水平較低，這種情況下，IL-6對腦的中樞神經系統具有營養、修復和免疫介導等正向生理作用，而當腦組織遭到過量的病原體入侵或發生損傷時，IL-6則會過度表達，而過高水平的IL-6則會參與甚至加重腦組織的神經損傷。對病毒性腦炎幼兒的研究表明，在腦炎的早期和恢復期，腦脊液、血漿中的IL-1β、IL-6的含量顯著高于對照組，且二者呈正相關，這就證明了IL-1β、IL-6兩種因子共同參和介導了腦組織急性免疫導致的炎癥損傷，進一步加重了腦組織受到的損害[8]。TNF-α則是一種可溶性的多肽，而入侵到體內的病毒、細菌、寄生蟲等則是刺激機體產生TNF-α的主要因素。TNF-α在中樞神經系統中，主要由腦中的神經細胞和膠質細胞合成。TNF-α在參與中樞神經系統炎性反應和對腦組織繼發性損傷方面起到了至關重要的作用，與其他炎性因子一樣，體內適當的TNF-α濃度對腦組織確實可以起到有益的保護作用，但過度的TNF-α表達則會加重腦損傷導致其神經細胞的變性、壞死。研究發現TNF-α主要以三種方式對中樞神經系統產生影響:一是神經外周的TNF-α通過神經介質作用于中樞神經系統或透過受損的血腦屏障進入腦的中樞神經系統；二是外周細胞直接進入中樞神經系統后，再產生TNF-α；三是中樞神經系統內活化的免疫細胞及神經元等分泌、合成并發揮生物學效應。有學者認為，TNF-α是其他炎性反應因子的始動因子，可以直接促進中性粒細胞向感染區組織聚集，誘導免疫細胞釋放IL-6、IL-1等一系列炎性因子[9]。研究還表明，TNF-α會加重感染病毒性腦炎后，腦組織的炎癥反應和并加重腦組織的損傷，TNF-α可以通過刺激機體產生急相蛋白，誘導內皮黏附分子的表達，并誘導免疫細胞分泌其他的炎性介質[10]。

研究表明，機體在受到病原體入侵時產生的炎癥反應與Toll受體家族參與的細胞通路密切相關。TLR-2是Toll受體家族的成員之一，主要存在于細胞膜上，是參與機體非特異性免疫反應的重要蛋白質分子，同時也是動物體內連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁。研究表明，TLR-2的過度表達會對宿主的抗病毒反應造成不利影響，進而加劇腦組織的炎癥損傷。研究還表明，活化的TLR-2會誘導TNF-α過度表達，從而導致致小鼠的血腦屏障通的透性提高，導致病毒更容易進入腦組織。已有研究表明，TLR-2在識別配體后可以進一步促進了IL-1、IL-6及TNF-α等炎癥因子的產生[11]。有報道指出，病毒表面的血凝集素多糖會刺激機體內TLR-2的過度表達。而森林腦炎病毒的研究指出，在病毒的表面也有血凝集素多糖的大量存在，因此在本實驗中，模型組大鼠的血液中的TLR-2水平顯著高于對照組，這也與前人的理論研究結果相一致。有報道指出，苦參堿能夠抑制大鼠內臟TNF和IL-6的分泌。還有研究指出，飼喂給患有關節炎的小鼠灌注含有訶子提取物的藥液可有效降低小鼠血清中IL-1β的濃度。本實驗中，中、高劑量的復方中藥可顯著降低感染森林腦炎小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量，這也與前人的研究成果相似，而低劑量組無明顯效果可能也與活性成分較少，說明本實驗中，藥物濃度過低無法對感染森林腦炎病毒小鼠的炎癥反應起到有效的調控作用。在本實驗中，與對檢測TLR-2的結果不同，陽性藥組對感染森林腦炎小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量有降低作用。這說明復方中藥與地塞米松調控感染森林腦炎小鼠驗證反應的機制并不相同。在本實驗中，中、高劑量的復方中藥可以顯著降低感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2的濃度。這可能是因為本實驗所用復方中藥包括了梔子和紫丁地花，研究表明，梔子和紫丁地花的活性成分能抑制兔巨噬細胞中Toll家族蛋白的表達，從而下調TNF-α、IL-1、IL-6的表達，降低兔的炎性反應。而低劑量和陽性藥組感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2的濃度并無顯著變化，造成這種情況的原因可能并不相同。低劑量的復方中藥對TLR-2的抑制作用較不明顯，可能是因為中藥中的活性成分較少，無法起到有效的生物學作用。而有研究表明，地塞米松對小鼠TLR-2的表達無顯著影響，而是對同樣是Toll受體家族的成員的TLR-4有調控作用，從而對免疫系統的炎性反應起調控作用。這說明，在本實驗中，中藥對炎癥反應的調控是通過TLR-2途徑來完成的，而陽性要組則可能是通過TLR-4途徑來完成的。

本實驗相關分析結果顯示，除陽性藥組外，其他各組小鼠血清中TLR-2與IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均呈高度正相關，說明TLR-2介導的信號轉導最終會促使IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量增加，之間的相互協同作用參與了腦組織的炎性反應，而應用復方中藥可以抑制TLR-2的過度表達，減少炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的產生，減輕炎性反應和小鼠腦組織損傷從而起到腦保護的作用。

4 結論

本實驗復方中藥所包含的苦參、訶子、川楝子、梔子和紫花地丁均具有降低動物體炎性反應的作用，通過對感染森林腦炎小鼠血清中TLR-2信號通路的最上游蛋白TLR-2和該通路的最下游產物IL-1β、IL-6、TNF-α的含量進行了檢測及相關性分析表明。本實驗復方中藥主要是通過抑制TLR-2的表達來下調感染森林腦炎小鼠的炎癥反應的，為下一步通路水平的研究提供了依據。