琴葉榕根提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用

1.廣東省梅州市中醫醫院中藥房，廣東 梅州 514071；2.嘉應學院醫學院，廣東 梅州 514031；3.嘉應學院醫學院附屬醫院藥劑科，廣東 梅州 514031

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是繼腫瘤、心腦血管疾病之后的嚴重威脅人類健康的第三大疾病，為全球性公共衛生難題[1]。目前，臨床治療糖尿病主要采用化學藥物療法，但其有效率僅有70%，且長期連續服藥會出現耐藥、胃腸道反應和肝臟損害等不良反應[2-3]。且2型糖尿病由于胰島素分泌不足及分泌高峰延遲，餐后血糖持續升高，進而引起血管內皮損傷、視網膜病變等并發癥[4]。因此，有效控制餐后血糖上升是防治糖尿病及其并發癥發生的重要途徑之一。 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是碳水化合物消化為葡萄糖的關鍵酶，為降低餐后血糖的有效分子靶標[5]，目前臨床上廣泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖，存在胃腸道反應[6]。從傳統中草藥中篩選新型的、安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為研究熱點。

琴葉榕為桑科榕屬琴葉榕FicuspandurataHance，又稱為牛奶樹根、牛奶子，主要分布于廣東、廣西、江西等地[7-8]，具有清熱、健脾開胃、溢氣生津、祛濕化滯等功效，用于祛風、去濕、解毒、通乳等[8]。在梅州地區民間常用琴葉榕的根制作藥膳，用于腰背酸痛、糖尿病、風濕病等的輔助治療，但其藥用及食用的科學內涵至今尚未明確，嚴重制約了琴葉榕根的開發利用[8-9]。實驗以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶為靶標，對琴葉榕根醇提取物和水提取物進行體外降血糖活性的比較研究，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 試藥 藥材琴葉榕根于2017年5月采購于廣東省梅州市梅江區美苑市場，經筆者丘建媚主管中藥師鑒定為桑科榕屬琴葉榕(FicuspandurataHance)的根部。

1.2 試劑 酵母來源α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase，批號：SLBT8587，美國 Sigma 公司)； α-淀粉酶(α-amylase，批號：SLBV0705，美國sigma 公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，批號：K26J8B39810 ，上海源葉科技有限公司)；3,5二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，批號：20170904，國藥集團化學試劑有限公司)；阿卡波糖(Acarbose，批號：BJ41706，德國拜耳有限公司)；甲醇和乙腈腈(色譜純，fisher scientific 公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 Alliance2695型高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)；UV-1800型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；MING-CHE 24ΜV型純水儀(法國Merck Millipore公司)；N-1100V型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；PB-21型pH計(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.4 實驗動物 雄性健康昆明種小鼠(由廣東省醫學實驗動物中心提供合格證號：SCXK(粵)2018-0002)，體重18～22g。實驗前動物適應性喂養1周。

2 方法

2.1 琴葉榕根提取物的制備 琴葉榕根干品1.0 kg，粉碎，加入適量超純水，回流提取2 h，提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根水提取物(73.47 g)，備用。

琴葉榕根干品1.0 kg，粉碎，加入適量的95%乙醇，浸泡12 h，超聲輔助提取(45℃，200 W，60 min)三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根乙醇提取物(90.42g)，備用。

2.2 酶溶液的制備

2.2.1 酵母來源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液(67 mmol/L，pH 6.8)溶解并定容于100 mL容量瓶，即得1.0 U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1 U/mL。

2.2.2 小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶參考文獻[10]的方法進行提取，采用頸椎脫位的方法處死小鼠，獲得小鼠小腸。分別采用4 ℃預冷的0.9% NaCl溶液和10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)清洗腸道脂肪組織，縱向切開，洗凈內容物，在濾紙上吸干，用剪刀剪碎后分別放入10 mL離心管中，加入4 ℃預冷的磷酸鈉緩沖液稀釋，置勻漿機勻漿，后于4 ℃下8000 r/min離心20 min，吸取上清液于10 mL離心管中，即得鼠源α-葡萄糖苷酶，-20 ℃冰箱貯存以備用，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1 U/mL。

2.2.3 α-淀粉酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液(67 mmol/L，pH 6.8)溶解并定容于1000 mL容量瓶，即得500.0 U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至3.75 U/mL。

2.3 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 琴葉榕提取物對酵母來源和小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制實驗的反應體系參考文獻[11]方法，并在其基礎上進行了改進，具體如下：將67 mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液250 μL、待測樣品50 μL(4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL)、0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶 300 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育 20 min，加入4.0 mmol/L pNPG 200 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫反應 30 min 后，加入碳酸鈉800 μL 終止反應，經0.45 μm 膜過濾后，采用 HPLC 檢測，按公式(1)計算對 α-葡萄糖苷酶的抑制率。阿卡波糖作為陽性對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率%=(A0-Ai+Aj)/A0×100% 公式(1)

注：A0 為緩沖液+酶液+底物反應后的 pNP 濃度；Ai:樣品+酶液+底物反應后的 pNP 濃度；Aj:樣品+緩沖液+底物反應后的 pNP 濃度。

2.4 色譜條件 色譜柱：XBridge Peptide BEH C18 柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相： 乙腈(A)～0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脫條件：0～8 min，20%～30% A；8～13 min，30%～80% A；13～15 min，80%～20% A；15～25 min，20% A。流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長315 nm。

2.5 對α-淀粉酶的抑制活性 參考文獻[12]，在反應體系中分別加入不同質量濃度的樣品溶液0.3 mL(4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL)，取0.3 mL α-淀粉酶溶液分別與樣品混合均勻，置于37 ℃水浴中預溫5 min，加入0.3 mL在37℃水浴中同時預溫5 min的1%可溶性淀粉溶液，混勻后反應15 min，立即加入0.5 mL DNS顯色并終止反應，置于沸水中煮沸5 min，隨后放置于冰水中靜置20 min，磷酸緩沖溶液定容至5 mL，在540 nm下測吸光值，按公式(2)求得 α-淀粉酶的抑制活性。實驗設陽性對照為阿卡波糖，空白對照為不加樣品和酶液，空白組不加樣品，背景對照為對應質量濃度的樣品及底物溶液(不加酶液和樣品以緩沖液補足)。

抑制率(%)=1-(A空白-A空白對照)/(A抑制劑-A背景對照) 公式(2)

注：A空白：空白組吸光值；A空白對照：空白對照吸光值；A抑制劑：抑制劑吸光值；A背景對照：背景對照吸光值。

3 結果

3.1 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 在α-葡萄糖苷酶的作用下，底物pNPG的糖苷鍵斷裂，水解成的亮黃色物質對硝基苯酚(pNP)，pNP在315 nm有最大吸收，可通過高效液相色譜(HPLC)紫外檢測器測定水解生成pNP的量。

3.1.1 精密度試驗 在無抑制劑的條件下，按照2.3項，進行活性實驗，同一份樣品，重復進樣6次，根據6次的pNP峰面積，計算得到RSD值為0.42%(n=6)，表明HPLC精密度良好。

3.1.2 穩定性試驗 在無抑制劑的條件下，按照2.3項，進行活性實驗，同一份樣品，分別于0、2、6、12、24 h進行測定，結果顯示pNP峰面積的RSD值為0. 60%，表明pNP在24 h內穩定性良好。

3.1.3 重復性試驗：在無抑制劑的條件下，按照2.3項，設6個實驗組，分別進行活性實驗，根據6次的pNP峰面積，計算得到RSD值為0.93%(n=6)，表明方法重復性良好。

3.1.4 對α-葡萄糖苷酶的抑制率測定 由圖1可知，無抑制時的pNPG和pNP色譜峰保留時間分別為4.99 min、11.96 min。此外，為考察提取物對pNPG和pNP的保留時間、峰型是否有影響，實驗設不加酶溶液的實驗組，結果見圖2。實驗結果表明，琴葉榕提取物對pNPG保留時間、峰型不產生影響。此外，在11.96 min也未檢測到峰，說明琴葉榕提取物在11.96 min沒有吸收，對pNP含量的檢測無影響，同時也表明琴葉榕提取物不會使底物pNPG分解產生pNP，可避免假陽性實驗的發生。

α-葡萄糖苷酶在抑制劑的作用下，隨抑制劑質量濃度的增大，其催化pNPG水解生成pNP的量減少，結果見圖3(以琴葉榕醇提取物對酵母來源α-葡萄糖苷酶的影響為例，其余相同)。圖中pNP(tR=11.96 min)峰面積由小到大對應的琴葉榕醇提取物質量濃度依次為4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL，表明隨琴葉榕醇提取物質量濃度的增大，酶抑制效果越強。

圖1 pNPG和pNP的HPLC

圖2 琴葉榕提取物對色譜峰的影響

圖3 琴葉榕醇提取物對酵母來源α-葡萄糖苷酶的影響

琴葉榕根乙醇提取物抑制酵母來源和小鼠小腸來源 α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(128.13±3.28)μg/mL、(531.04±5.72)μg/mL，均顯著低于水提取物(見表1)，提示琴葉榕根乙醇提取物對 α-葡萄糖苷酶的抑制活性強于水提取物。

表1琴葉榕根提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制結果

樣品IC50 /μg/mLα-葡萄糖苷酶酵母菌來源小鼠小腸來源α-淀粉酶阿卡波糖2872.12±4.241321.03±4.55 29.57±1.44水提取物1923.45±3.24?2232.27±5.76?1141.28±1.23?乙醇提取物 128.13±3.28?#531.04±5.72?#714.25±4.37?#

注：與對照組阿卡波糖比較，*P<0.05；與樣品組水提取物比較，#P<0.05。

3.2 對α-淀粉酶的抑制活性 琴葉榕根乙醇提取物對α-淀粉酶的IC50值為(714.25±4.37)μg/mL，顯著低于水提取物(1141.28±1.23)μg/mL(P<0.05)，提示琴葉榕根乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制活性強于水提取物(見表1)。

4 討論與結論

琴葉榕在客家地區常作滋補湯料，配以龍骨、雞肉煲湯，用于祛濕、降糖等。據《江西民間草藥驗方》、《福建中草藥》等客家地區經典著作記載，牛奶樹根祛風除濕、清熱解毒、活血行氣、舒經通絡等功效明顯[13]。琴葉榕藥用和食用價值高，市場經濟價值潛力巨大，但其現代藥學研究薄弱。實驗以琴葉榕根為研究對象，對其醇提取物和水提取物進行降血糖活性評價，并進行活性差異的比較研究，結果表明，琴葉榕根乙醇提取物和水提取物對兩種來源α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有顯著的抑制活性，其中乙醇提取物抑制活性強于水提取物。結果提示應聚焦于琴葉榕根乙醇提取物，并對其進行系統的化學成分、藥理活性研究，明確藥效物質基礎以及作用機制，推動琴葉榕的進一步開發利用。