不同提取方法對太子參多糖含量的影響

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1.福建省中醫藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003

福建道地藥材太子參在柘榮縣已有近百年的人工栽培歷史，太子參的生產、加工成為當地支柱型產業。多糖是太子參中重要活性成分之一，研究表明，太子參多糖具抗氧化[1]、免疫調節[2]、抗糖尿糖[3-4]、及心肌保護[5]等多種活性。太子參多糖的高效生產對于太子參產業的發展尤為重要，在多糖生產過程中，如何在提高提取率的同時，降低生產能耗和成本，是多糖生產工藝中的難點。

目前，中藥多糖提取方法主要有熱水提取法、酸/堿提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶提取法、超臨界萃取法和超高壓提取等，其中熱水提取法工藝成本較低、操作簡單，是最傳統的提取方法；超聲提取具有時間短、效率高、節約能耗等特點；酶提取法可有效破壞藥材致密的細胞壁結構，促進多糖的溶出[6]。本研究分別采用熱水提取法、超聲提取法、酶提取法3種方法提取太子參多糖，比較不同提取方法對太子參粗多糖的得率、總多糖含量的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-3200型紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；AE240S電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KQ2200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sorall ST 16R高速冷凍離心機(Thermo Fisher公司)；MOKULYOD-230型冷凍干燥儀(Thermo Fisher公司)。

1.2 材料 太子參藥材購于福建柘榮太子參市場；纖維素酶(批號：20170309)、乙醇(批號：20170424)、苯酚(批號：20161018)等購于國藥集團化學試劑有限公司；硫酸(批號：160123，西隴化工股份有限公司)；D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201506，中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結果

2.1 多糖的提取

2.1.1 熱水提取法 精密稱取太子參粉末20.00 g，加入400 mL蒸餾水，回流提取1 h，濾渣重復提取2次，合并3次續濾液，旋蒸濃縮至約100 mL；加入4倍量無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心(4000 r/min, 10 min)，收集沉淀。向沉淀中加入100 mL蒸餾水，充分溶解，重復醇沉1次。收集沉淀冷凍干燥，稱重，計算粗多糖得率，既得熱水提取法太子參粗多糖。

2.1.2 超聲提取法 精密稱取太子參粉末20.00 g，加入400 mL蒸餾水，超聲(350 W，40℃)提取0.5 h，濾渣重復提取2次，合并3次續濾液后處理方式同熱水提取法，既得超聲提取法太子參粗多糖。

2.1.3 酶提取法 精密稱取太子參粉末20.00 g，加入400 mL蒸餾水，加入0.5 g纖維素酶55℃浸泡1 h，煮沸10 min對酶進行滅活，過濾，濾渣重復提取2次，合并3次提取所得濾液后處理方式同熱水提取法，既得酶提取法太子參粗多糖。

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取D-無水葡萄糖對照品20.02 mg，加蒸餾水溶解，定容至200 mL容量瓶中，配制成濃度為100 μg /mL的對照品儲備液，分別精密量取葡萄糖標準品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 置于10 mL 的具塞試管中，分別添加蒸餾水至2 mL，并且各加5%苯酚溶液1 mL，混勻，緩緩加入硫酸5 mL，搖勻；沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min。用1 mL蒸餾水按同法反應作為空白對照，分別在490 nm 波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。并得到回歸方程：y=0.0072x+0.0167，r=0.9991，表明葡萄糖在10.01～90.09 μg/mL范圍內線性關系良好。標準曲線如圖1所示。

2.2.2 精密度試驗 精密稱取太子參粗多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取太子參多糖溶液1mL，共6份，分別置10 mL具塞試管中按標準曲線項下方法顯色，測定吸光度，計算其相對標準偏差RSD為3.35%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗 精密吸取太子參粗多糖供試液，按標準曲線項下方法顯色，分別于0、15、30、60、90、120 min測定吸光度，考察其穩定性，結果相對標準偏差RSD為0.72 %，表明在120 min內樣品具有良好的穩定性。

2.2.4 重現性試驗 精密稱取太子參粗多糖5份，按標準曲線項下方法顯色，測定吸光度，計算其相對標準偏差RSD為2.56%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取太子參粗多糖10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，準確移取供試液8份，每份5 mL，轉移至10 mL容量瓶，分別加入0.5 mg/mL葡萄糖溶液0、0.5、1、1.5 mL，加超純水定容至刻度，測定吸光度，計算含量及回收率，加樣回收率試驗結果見表1。

2.2.6 總多糖的測定 精密稱取不同提取方法的太子參粗多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入超純水，超聲溶解，定容。精密吸取各多糖溶液1 mL，按照上述標準曲線方法進行顯色反應后測定吸光度，代入標準曲線計算各多糖含量。

表1 葡萄糖加樣回收率測定結果

表2 不同方式提取得到的太子參粗多糖得率及總多糖含量比較

通過對不同提取方式得到的粗多糖得率及總多糖含量進行對比(表2)，結果顯示太子參粗多糖得率受提取方法的影響很大，熱水提取法、超聲提取法和酶提取法獲得太子參粗多糖得率分別為14.54%、11.12%和17.81%，粗多糖得率由高至低依次為酶提取法>熱水提取法>超聲提取法。酶提取法所得粗多糖與熱水提取法和超聲提取法相比純度較低。熱水提取法(10.18%)和酶提取法(10.69%)所得太子參總多糖含量相當，均高于超聲提取法(8.68%)。

4 討論

研究采用熱水回流提取法、超聲提取法和酶法分別提取太子參多糖，結果顯示熱水回流和酶法提取所得粗多糖得率高于超聲提取法。回流提取法較高的提取溫度有利于提取溶劑進入藥材內部，增加藥材與提取溶劑的接觸；酶提取法利用纖維素酶分解太子參細胞壁結構，在一定程度上可以促進細胞內部多糖的溶出和提高太子參中纖維素源多糖的提取率，因此，熱水回流和酶提取法更有利于太子參多糖的高效提取。在實用性方面，超聲波提取法需要專門設備，且設備要求技術含量較高，不適用于工業化大生產。酶提取法所需設備簡捷，操作簡便，但存在提取成本較高和多糖產物純度較低等問題。熱水回流提取法在工業上已有較成熟的提取設備，且提取時間短、提取率高，較為適用于太子參多糖的生產。

該試驗采用的室溫條件下超聲提取法對太子參多糖提取率要低于熱水提取法和酶提取法，說明較高的溫度可能更有利于太子參多糖的溶出，但是高溫的提取環境容易破壞多糖的空間結構，從而影響其生物活性；而相對較低的提取溫度，可能會更好的保持多糖獨特的性質[7]，關于不同提取條件下太子參多糖生物活性的研究有待進一步深入。