海南五指山豬TLR4基因克隆及生物信息學分析

黃麗麗　張艷　劉海隆　林哲敏　譚樹義

摘要：為獲得海南五指山豬TLR4基因序列并分析其分子結構特征，以GenBank中豬的TLR4基因序列為參考序列，采用PCR技術對該基因組序列進行克隆、測序及相關生物信息學分析。結果顯示，獲得的五指山豬TLR4基因DNA序列長10 435 bp，其中編碼區全長2 526 bp，共編碼841個氨基酸;與GenBank中發布的普通豬的TLR4基因序列相比，存在38處突變（其中有2處突變位于編碼區）;與普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、62.5%、43.4%;五指山豬TLR4編碼的蛋白屬于分泌性蛋白和跨膜蛋白，具有親水性，有8個糖基化修飾位點、17個絲氨酸（ser）、7個蘇氨酸（Thr）及8個酪氨酸（TYR）磷酸化位點;氨基酸系統進化樹分析表明，不同物種TLR4基因在進化過程中具有較高的保守性。該結果為進一步深入研究TLR4基因的功能奠定基礎。

關鍵詞：五指山豬;TLR4基因;克隆;生物信息學分析

中圖分類號： S828.1;Q785文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0041-05

Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種模式識別受體，其可特異性地識別革蘭氏陰性菌表達的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或脂質A（LPS的活性成分），快速啟動免疫反應，誘導各種炎性介質釋放，激活相關免疫細胞來抵抗微生物的入侵，在動物機體的免疫反應和炎癥等方面起重要作用[1]。目前，TLR4基因在免疫和感染領域研究較熱。大量研究表明，TLR4基因的缺失或突變可能會誘發細胞對LPS的反應性減弱或喪失，導致機體對疾病易感性增加。如TLR4基因缺失會加重慢性阻塞性肺炎患者的肺損傷[2];近端腫瘤和轉移性疾病的發生與TLR4基因的突變相關[3];TLR4基因突變會增加兒童患慢性腎盂腎炎的風險[4]。

海南五指山豬是重要的試驗動物資源之一，也是國家試驗用小型豬種質資源中心的首選豬種，社會、經濟價值頗高。目前，尚未見到關于海南五指山豬TLR4基因克隆和相關功能結構預測的研究報道。因此，本研究于2016年6月以五指山豬為研究對象，利用克隆測序方法尋找五指山豬TLR4基因中的突變位點，并利用生物信息學軟件對其序列進行分析和功能預測，為進一步研究五指山豬TLR4的功能及其基因遺傳變異與免疫疾病的關系提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物與樣本采集

選用10頭海南省農業科學院畜牧獸醫所永發豬場的五指山豬作為研究對象，[JP3]采集血液樣品后，于-20 ℃保存于海南省農業科學院畜牧獸醫所實驗室備用。

1.1.2主要試劑

血液基因組DNA提取試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒、重組質粒抽提試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD18-T載體試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司;克隆宿主菌JM109，由海南省農業科學院畜牧獸醫所實驗室提供。

1.1.3引物設計與合成

根據GenBank中TLR4基因序列（登錄號為AY753179.1）設計合成11對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，取部分DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.2.2PCR擴增

PCR擴增體系為：DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer（不含Mg2+）2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，Ex Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，P1（10 pmol/L）0.5 μL，P2（10 pmol/L）0.5 μL，無菌去離子H2O 15 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min;94 ℃ 變性50 s，退火50 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸 2 min，30 個循環;最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3基因克隆及序列測定

利用膠回收試劑盒回收純化PCR產物，將其連接到pMD18-T easy載體，再轉化至JM109感受態細胞后，涂布含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素的平板，37 ℃培養，挑取白斑接種于LB培養基中增菌培養后，經菌液PCR和酶切鑒定正確的送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4生物信息學分析

利用DNAMAN軟件對DNA序列進行比對拼接; 應用NCBI的ORF Finder程序尋找序列的開

放閱讀框;利用MEGA（6.0）軟件構建系統發育進化樹;利用ProtParam（http：//web. expasy. org / protparam/）程序、Protscale軟件、NetPhos 2.0 TMHMM程序、NetNGlyc（http：// www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos /）程序分析蛋白的特性，利用Signal P 4.1 Server 程序預測信號肽;利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM）軟件預測跨膜結構域;利用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat. pl？ page =npsa_sopma. html）、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白的結構;通過PSORT I1程序進行亞細胞定位。

2結果與分析

2.1五指山豬TLR4基因的克隆

使用11對引物擴增五指山豬TLR4基因，分別獲得長度為370、1 406、1 477、1 960、1 428、1 661、1 618、1 284、1 248、1 396、1 433 bp的DNA序列（圖1）。

2.2五指山豬TLR4基因組序列分析

測序拼接后獲得全長為10 435 bp的五指山豬TLR4基因DNA序列，其中CDS長2 526 bp，編碼841個氨基酸（圖2）。與GenBank發布的普通豬TLR4基因序列相比，存在38處突變（表2）;其中在CDS區序列存在2處突變，1處為無義突變，在7 779位點由G突變為A，不引起氨基酸變化;另1處為有義突變，7 781位點由G突變為A，氨基酸由精氨酸變為組氨酸。

2.3五指山豬TLR4氨基酸序列的同源性比對及系統進化樹構建

由圖3可知，五指山豬TLR4基因氨基酸序列同GenBank中已發布的普通豬（登錄號AAW82895.1）、牛（登錄號NP_776623.5）、綿羊（登錄號NP_001129402.1）的氨基酸序列的同源性較高，分別為99.9%、80.7%、79.9%;與犬（登錄號NP_001002950.2）、馬（登錄號NP_001093239.2）、獼猴（登錄號NP_001032169.1）、人（登錄號NP_003257.1）、黑猩猩（登錄號BAG55036.1）、小鼠（登錄號NP_067272.1）的同源性[CM（25]稍低，分別為74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、

62.5%;與雞（登錄號ACR26315.1）的同源性最低，為 43.4%。采用MEGA 6.0軟件的NJ法系統構建進化樹，結果（圖3）顯示，五指山豬TLR4基因與普通豬的親緣關系最近，隨后依次是綿羊、牛、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞。

2.4五指山豬TLR4蛋白理化特性分析

經ProtParam軟件在線預測顯示，五指山豬TLR4蛋白分子量為96 312.93 u，等電點為6.12，分子式為 C4 378H6 808N1 146O1 241S30。其氨基酸組成及比例分別為：丙氨酸（Ala，4.4%）、精氨酸（Arg，3.4%）、天冬酰胺（Asn，6.7%）、天冬氨酸（Asp，4.6%） 、半胱氨酸（Cys，2.3%）、谷氨酰胺（Gln，5.2%）、谷氨酸（Glu，5.7%）、甘氨酸（Gly，3.7%）、組氨酸（His，3.9%）、異亮氨酸（Ile，5.6%）、亮氨酸（Leu，16.1%） 、賴氨酸（Lys，5.1%）、甲硫氨酸（Met，1.3%）、苯丙氨酸（Phe，6.7%）、脯氨酸（Pro，3.7%）、絲氨酸（Ser，8.6%）、蘇氨酸（Thr，3.8%）、色氨酸（Trp，1.1%）、酪氨酸（Tyr，2.5%）、結氨酸（Val，5.7%）、吡咯賴氨酸（Pyl，0.0）、硒半胱氨酸（Sec，0.0）。SignalP-4.1軟件預測發現，五指山豬TLR4蛋白有信號肽序列，說明其為分泌性蛋白（圖5-A）。經Prot Scale軟件分析發現，五指山豬TLR4蛋白841個氨基酸當中疏水性氨基酸最大值為2.811，親水性氨基酸最小值為-2.867，大多數氨基酸為親水性，屬于親水性蛋白（圖5-B）。利用Tmhmm軟件分析發現，五指山豬TLR4有1個跨膜區，屬于跨膜蛋白（圖5-C）。

2.5五指山豬TLR4蛋白結構預測

應用SOPMA程序預測五指山豬TLR4蛋白的二級結構發[CM（25]現，五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋（47.44%）、延伸鏈（17.36%）、β-轉角（8.44%）和無規則卷曲（26.75%）組成（圖6）。利用SWISS-MODEL在線軟件對五指山豬TLR4蛋白的三級結構預測后發現，TLR4蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲組成（圖7），與二級結構預測結果相符。

2.6五指山豬TLR4蛋白亞細胞定位、磷酸化和糖基化位點預測及功能預測分析

定位分析發現，五指山豬TLR4蛋白在內質網、線粒體、膜泡分泌系統、細胞質、細胞外基質、質膜中均有分布，其比例分別為33.30%、22.20%、11.10%、11.10%、11.10%和 11.11%，其中在內質網中分布最多。磷酸化分析顯示，五指山豬TLR4蛋白存在17個絲氨酸（ser）、7個蘇氨酸（Thr）和8個酪氨酸（TYR）磷酸化位點。糖基化位點分析表明，五指山豬TLR4蛋白存在8個糖基化修飾位點，分別位于氨基酸序列的第35、第205、第238、第282、第309、第526、第575和第625位。

3討論與結論

TLR4在天然免疫系統調節、炎癥和組織損傷修復中發揮關鍵作用，不僅可以識別細菌脂多糖，還可被損傷誘發的內源性介質激活[5]。雖然大量研究都選擇TLR4基因作為抗病的候選基因進行研究，但TLR4基因的變異與疾病的確切關系還不清楚。

本研究采用PCR法克隆了五指山豬的TLR4基因，序列分析結果顯示，五指山豬TLR4基因DNA序列長10 435 bp，其中CDS長為2 526 bp，共編碼841個氨基酸。與GenBank發布的普通豬TLR4基因序列相比，存在38處突變;其中在CDS區序列存在2處突變（1處為無義突變，另1處為有義突變，氨基酸由精氨酸變為組氨酸），說明五指山豬與普通豬TLR4基因的生物學功能可能存在一些差異。同源性分析結果顯示，五指山豬TLR4基因氨基酸序列同普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73.0%、72.7%、62.5%、43.4%，說明TLR4基因在不同物種間相對保守，但仍存在著一定的種屬特異性。

蛋白質的功能與其空間結構有密切關系[6]。研究分析發現，五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲組成。其中α-螺旋是蛋白質中常見的、 含量也最豐富的二級結構原件，而無規則卷曲通常會構建成特性功能部位或是酶活性部位[7]。五指山豬TLR4蛋白有信號肽序列，說明其為分泌性蛋白;有1個跨膜區，說明其為跨膜蛋白，可能參與信號傳導;蛋白中有許多親水性氨基酸，因而該蛋白也具有親水性。

磷酸化和糖基化是生物體蛋白質翻譯后常見的修飾方式，廣泛參與調節許多生命活動[8-9]，如干擾機體對抗原的應答反應，影響病毒的體外增殖[10]。對五指山豬TLR4蛋白進行磷酸化和糖基化位點分析后發現，五指山豬TLR4蛋白存在17個絲氨酸、7個蘇氨酸和8個酪氨酸磷酸化位點，有8個糖基化修飾位點，但這些磷酸化和糖基化修飾位點對該基因的作用內容還須進一步深入研究。

參考文獻：

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