響應面法優化牡丹花化學成分提取工藝的研究

崔莉　趙恒強　耿巖玲　王志偉　王曉　閆慧嬌

摘要：為了確定牡丹花化學成分提取的最佳工藝條件，從化學成分的穩定性和操作的便捷性考慮，用超聲法對牡丹花的提取工藝進行研究。以液相色譜圖中14個共有峰的總峰面積為指標，分別考察超聲提取時間、乙醇濃度、液料比對牡丹花多種化學成分共同提取效果的影響，用響應面法優化牡丹花的超聲提取工藝。結果表明，乙醇濃度對牡丹花提取效果的影響最大，其次是液料比與超聲時間，用響應面法優化得到牡丹花超聲提取的最適工藝條件如下：乙醇濃度為 60.92%，液料比為86.21 mL ∶1 g，超聲時間為24.34 min。通過驗證試驗發現，在此最佳提取條件下，色譜圖中共有峰峰面積的總和與預測值相近，可見通過響應面優化得到的牡丹花化學成分提取工藝穩定、可行。

關鍵詞：牡丹花;提取工藝;超聲法;響應面法;Box-Behnken設計

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0212-05

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為毛茛科芍藥屬灌木，有“富貴花”和“花中之王”的美稱，是中華民族傳統文化的重要組成部分，享有“國花”的盛譽[1]。牡丹花在我國有悠久的藥用和食用歷史，《四川中藥志》中記載：牡丹花性平、苦、淡，具有調經活血的功能，主治月經不調、痛經[2]。明代的《遵生八菚》中曾記載：“牡丹新落花瓣亦可煎食”。清代的《養小錄》中記載：“牡丹花瓣，湯淖可，蜜浸可，肉汁燴亦可”，2013年，丹鳳牡丹花被中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會（現為中華人民共和國國家衛生健康委員會）批準為新食品原料[3]，是我國寶貴的天然植物資源。然而，在傳統的牡丹產業中，牡丹花常被當作廢棄物丟棄，造成巨大的浪費。

牡丹花中的活性成分種類較多，含量豐富，現代研究證明，這些成分具有活血、殺菌、抗氧化等多種活性[4-7]。在前期研究中，筆者對牡丹花的化學成分進行了系統分離，發現其次生代謝產物主要包括黃酮類、沒食子酸類、鞣質類及其芍藥苷類單萜苷類化合物[8-11]。而目前有關牡丹花化學成分提取的研究多針對黃酮類，且以總黃酮提取率作為方法優劣的判斷標準[12-15]，無法為全面表征牡丹花的生物活性物質基礎，從而從整體上評價牡丹花的質量提供參考。響應面設計（response surface methodology，簡稱RSM）是一種有效的統計和優化方法，在試驗條件優化的過程中可以連續地對試驗因素的各個水平進行分析，并能給出直觀的圖形[16-21]。筆者在前期對牡丹花的化學成分研究的基礎上，對其主要化學成分進行了辨認，并以液相色譜中的共有峰（包括黃酮類、沒食子酸、鞣質類、芍藥苷）的總峰面積為響應值，運用Design-Expert軟件進行響應面Box-Behnken設計，對牡丹花提取工藝進行優化，擬為牡丹花資源的綜合開發利用及質量控制提供理論依據。

1材料與方法

1.1儀器與材料

Agilent 1120型高效液相色譜儀[配有二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器，美國Agilent公司];KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）。

牡丹花采自山東菏澤，于2017年4月采收新鮮丹鳳牡丹的花瓣，于50 ℃熱風烘干，粉碎過40目篩，在山東省分析測試中心實驗室的干燥器內避光保存。主要試劑如下：乙醇，分析純，購自德州恒業化工有限公司;甲醇、乙腈，色譜純，購自山東禹王試劑有限公司;甲酸，色譜純，購自德國Riedel公司;其余試劑均為分析純。試驗用水為超純水。對照品芍藥苷、野漆樹苷、紫云英苷，購自中國食品藥品檢定研究院;1-O-galloyl-β-D-glucopyranose（1-O-沒食子酰基-β-D葡萄糖）、1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose（1，2，3，4，6-O-五沒食子酰基-β-D葡萄糖）、kaempferol-3，7-di-O-β-D-glucopyranoside（山柰酚-3，7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、沒食子酸、沒食子酸甲酯、大波斯菊苷、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、氧化芍藥苷由筆者所在實驗室分離、純化后，經核磁、質譜、紅外、紫外鑒定，純度均達99%（相對純度）以上。

1.2試驗方法

1.2.1對照品溶液的制備分別取適量1-O-沒食子酰基-β-D葡萄糖、沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰基-β-D葡萄糖、野漆樹苷、紫云英苷、大波斯菊苷這11種對照品，加甲醇配制成質量濃度分別為45.5、45.2、60.0、25.3、25.4、60.0、720.0、61.0、101.0、60.0、81.2 mg/L的混合對照品溶液。

1.2.2液相色譜條件采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC），色譜柱采用Micro C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。以0.1%甲酸 （A）- 乙腈（B）溶液為流動相進行梯度洗脫：0～5 min，5% B;5～8 min，5%～12% B;8～23 min，12% B;23～24 min，12%～15% B;24～30 min，15% B;30～31 min，15%～21% B;31～38 min，21% B;38～39 min，21%～22% B;39～48 min，22% B;48～53 min，22%～34% B;53～63 min，34% B;63～64 min，34%～90% B;64～69 min，90% B;流量為 1.0 mL/min;進樣量為10 μL，檢測波長為270 nm。

1.2.3牡丹花瓣提取方法的選擇精確稱取10份牡丹花瓣粉末，每份0.50 g，置于具塞錐形瓶中，各加入50 mL溶劑，稱定質量，其中5份樣品分別用50%乙醇于65 ℃浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，另外5份樣品分別用50%乙醇超聲提取5、10、30、50、70 min。提取后靜置至室溫，稱量并補足至提取前的質量，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，按照“1.2.2”節的方法進樣檢測。

1.2.4牡丹花瓣超聲提取法的工藝流程精確稱取10份牡丹花瓣粉末，每份0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL不同濃度的乙醇，稱質量，超聲提取（250 W，40 kHz），冷卻至室溫，稱量并補足至提取前的質量，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

1.2.5牡丹花瓣超聲提取工藝參數的單因素試驗分別考察不同超聲提取時間（10、20、30、40、50 min）、乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）和液料比（20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g）對牡丹花瓣提取效率的影響。

1.2.6響應面法優化牡丹花超聲提取工藝試驗在單因素試驗的基礎上，確定液料比、乙醇濃度和超聲時間3個因素的水平，用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應面設計和數據分析。具體試驗因素與各水平設計見表1。

2結果與分析

2.1牡丹花化學成分的分析

在前期對牡丹花化學成分進行系統分離的基礎上，通過與對照品進行高效液相色譜比對，對其化學成分進行了分析，共確定14個共有峰中的11個成分，圖1中的1號峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose，2號峰為沒食子酸，3號峰為氧化芍藥苷，4號峰為沒食子酸甲酯，5號峰為二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6號峰為kaempferol-3，7-di-O-β-D-glucopyranoside，7號峰為芍藥苷，9號峰為1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose，11號峰為野漆樹苷，12號峰為紫云英苷，13號峰為大波斯菊苷。

2.2牡丹花瓣化學成分提取方法的選擇

選擇色譜圖中信噪比（S/N）>30的14個共有峰作為評價指標，以50%乙醇超聲處理20 min的單位樣品峰面積為1，計算不同處理方法下樣品的共有峰峰面積提取率，并進行比較。從圖2可以看出，不同提取方法對各共有峰的峰面積影響不明顯，超聲法提取率稍高于溫浸法，9號峰的峰面積提取率在20 min、1 h最高，但是隨著提取時間的延長，提取率反而下降，而1、2號峰則相反。通過與對照品圖譜對應保留時間（圖1-a）的對比可初步推測，1號峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose，2號峰為沒食子酸，9號峰為1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose，可能由于提取時間的延長，部分沒食子酰鞣質發生水解，生成沒食子酸或沒食子酰基葡萄糖。從總體上看，超聲法用時較短，考慮到操作的便捷性，選擇超聲法作為牡丹花化學成分的提取方法。

2.3牡丹花瓣超聲提取工藝參數的單因素試驗

2.3.1液料比對提取效果的影響固定超聲時間為20 min，乙醇濃度為60%，選擇液料比20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g進行試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標，由圖3-a可以看出， 隨著液料比的增加，共有峰的總峰面積逐漸增加，當液料比大于100 mL ∶1 g時，共有峰的總峰面積增勢變緩，提取趨于完全，考慮到成本及后處理，選擇100 mL ∶1 g作為較優的液料比。

考慮到在提取過程中會發生部分沒食子酰鞣質水解生成沒食子酸或沒食子酰基葡萄糖的反應，這幾種成分的含量變化可反映不同參數條件對牡丹花化學成分提取效果的綜合影響，因此同時選擇1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose（9號峰）、沒食子酸（2號峰）的峰面積比值（峰9/峰2）作為評價指標，進一步考察單因素試驗的提取效果。圖3-b結果顯示，液料比對兩峰比值有一定的影響，隨著液料比的增加，兩峰面積比值逐漸提高，當液料比大于 100 mL ∶1 g 時，兩峰面積比值逐漸降低。

2.3.2乙醇濃度對提取效果的影響固定液料比為 100 mL ∶1 g，超聲時間為20 min，選擇20%、40%、6%、80%、100%的乙醇濃度對牡丹花進行提取試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標，由圖4-a可以看出，當乙醇濃度為60%時，共有峰的總峰面積達到峰值;當乙醇濃度為80%時，提取效果又有所減弱。因此，選擇60%為最優乙醇濃度。從9號峰、2號峰的峰面積比值來看，使用不同比例的溶劑提取時，對兩者的提取效率不同，當乙醇濃度為80%時，化合物9、化合物2的峰面積比值最大（圖4-b），推測是由于2種化合物的極性不同造成的。

2.3.3超聲提取時間對提取效果的影響固定液料比為100 mL ∶1 g，乙醇濃度為60%，選擇超聲時間為10、20、30、40、50 min 進行試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標，由圖5-a可以看出，超聲20 min后，總峰面積趨于平穩，基本實現了提取完全，50 min時則略有下降，可能由于超聲時間過長，導致提取溫度升高，牡丹花內的部分化學成分發生了降解。由圖5-b可以看出，9號峰、2號峰的峰面積比值呈現先提高后降低的趨勢，超聲提取20 min后，隨著提取時間的延長，峰面積比值下降，部分沒食子酰鞣質發生水解，生成沒食子酸或沒食子酰基葡萄糖。為更好地保持牡丹花化學成分的穩定，同時節約能源，選擇20 min為最優超聲時間。

2.4響應面法優化牡丹花化學成分的超聲提取工藝試驗

根據Box-Behnken的組合設計原理，用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平共15個試驗，中心點重復3次試驗，以色譜圖中S/N>30的14個共有峰的總峰面積為響應值（R），具體試驗設計方案與結果見表2。

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的綜合評價數據進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程：R=14 138.40+105.25[KG*3]×[KG*3]A+[KG*3]243.13[KG*9]×B+22.63×C-5.75×AB+13.75×AC+2.50×BC-84.45×A2-1 296.20×B2-36.20×C2。由表3的回歸模型方差分析結果可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對提取效果有極顯著影響。本試驗模型的P<0.01，說明響應面的模型顯著性較高，而失擬誤差項的P>0.05，說明響應面模型對試驗擬合的情況較好，試驗誤差較小，可以很好地對牡丹花超聲提取效果進行分析和預測。

響應面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值的影響。由圖6可以看出，乙醇濃度對牡丹花提取效果的影響最大，其次是液料比，超聲時間對牡丹花提取效果的影響最小。液料比與超聲時間的交互作用對牡丹花提取效果的影響較大，其次為液料比與乙醇濃度的交互作用，乙醇濃度與超聲時間的交互作用影響最不明顯。

2.5驗證試驗

用Design-Expert 8.0.6軟件優化得到牡丹花超聲提取的最佳工藝如下：液料比為86.21 mL ∶1 g，乙醇濃度為 60.92%，超聲時間為24.34 min，在此條件下總共有峰面積的預測值為14 189。為驗證響應面法所得結果的可靠性，對模型[CM（25]優化的工藝條件進行驗證。考慮到試驗的可行性與便捷性，選擇液料比86 mL ∶1 g、乙醇濃度61%、超聲時間24 min進行3次試驗。由表4的驗證結果可以看出，方程與真實試驗情況擬合得較好，優化的工藝可靠、可行。

3結論與討論

由于響應面法是在單因素試驗的基礎上得到相應的點，并從這些點中獲得1個完整、連續的面，再在此面中獲得最優值。因此，在響應面整體設計中，單因素試驗中變量參數的選擇顯得格外關鍵。本研究先通過單因素試驗選取提取時間、乙醇濃度、液料比3個工藝變量合適的參數水平。由于牡丹花中含有的芍藥苷等單萜苷類化合物及一些易水解的鞣質類化合物對溫度較為敏感，在高溫下穩定性較差，不宜使用高溫浸提，與本試驗中提取方法初篩的結果相一致，并且超聲法具有提取效率高、操作簡單、節能等優點，可作為較優的牡丹花提取方法。

本研究使用3因素3水平的響應面分析法對牡丹花超聲提取工藝的提取時間、乙醇濃度、液料比進行考察，獲得的最佳提取工藝條件為乙醇濃度60.92%、液料比86.21 mL ∶1 g、超聲時間24.34 min，并通過驗證試驗證明了該條件參數的可行性，在該條件下，牡丹花化學成分的提取更為全面、充分，可用于牡丹花質量的綜合評價，并可為牡丹的綜合利用、開發提供依據。

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