絲膠蛋白對2型糖尿病模型大鼠腎臟細胞外信號調節激酶表達的影響

宋妤軒 王丹丹 李東哲 史碩 陳志宏 宋成軍

(承德醫學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000)

目前，糖尿病腎病已成為僅次于原發性腎小球腎炎的導致終末期腎病的第二位原因〔1〕。當糖尿病患者出現尿中泡沫增多、尿量改變(減少或增多)、容易疲倦等表現時，應高度警惕糖尿病腎病的可能。糖尿病患者進展至糖尿病腎病時代謝紊亂更加復雜，尤其是發展到終末期腎病，在治療上更加困難。因此，盡早防治對于延緩糖尿病腎病的進程意義重大〔2〕。本研究提取彩色蠶繭(黃色蠶繭)中的絲膠蛋白，并給予2型糖尿病模型大鼠灌胃，觀察大鼠腎臟細胞外信號調節激酶(ERK)表達的變化，為探尋高效、毒副作用輕的改善糖尿病腎臟損傷的天然物質提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠，體重200～250 g，購自河北醫科大學實驗動物中心(合格證書號712024)，飼養于承德醫學院實驗動物中心。絲膠的提取和制備：承德醫學院蠶業研究所提供彩色蠶繭，純水浸泡蠶繭后煎煮2次，過濾、合并濾液，加熱濃縮，4℃保存，灌胃前用37℃水浴箱復溫〔3〕。購于美國Sigma公司的鏈脲佐菌素(STZ)，使用前用pH4.4的枸櫞酸鈉/枸櫞酸緩沖液配制，濃度為2%；血糖檢測試劑盒購于保定長城臨床試劑有限公司；尿素氮、肌酐檢測試劑盒購于北京首醫臨床科技中心；尿蛋白酶免分析法(EIA)檢測試劑盒購于法國SPI公司；BCA蛋白定量試劑盒購于北京泰格美科技有限公司；兔抗大鼠pERK1/2多克隆抗體(一抗)購于北京博奧森生物技術有限公司；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；山羊抗兔、小鼠IgG二抗購于美國KPL公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；ERK和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；一步法RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、制備模型和用藥 建立模型的方法：2%的STZ以25 mg/kg的劑量給予大鼠腹腔注射(連續3 d)，注射STZ 7 d后空腹血糖不低于16.7 mmol/L作為2型糖尿病大鼠造模成功的標準〔4〕。24只成功建模大鼠隨機平均分為模型組和絲膠蛋白組，模型組不做任何處置，絲膠蛋白組按照2.4 g/(kg·d)的劑量灌胃給予絲膠(連續35 d)。另取12只大鼠作為正常對照組，常規飼養。

1.2.2 取材 處死前1 d用代謝籠收集3組24 h尿液，記錄尿量。然后，在大鼠腹腔內注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.5 g/kg，通過內眥使用毛細玻璃管收集眶后靜脈叢的靜脈血，3 000 r/min離心20 min(京立LD4-2A離心機)，收集血清，-20℃冰箱保存。大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.2.3 檢測24 h尿蛋白含量 采用EIA方法使用相應試劑盒檢測。

1.2.4 檢測血液指標 應用日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖，谷氨酸脫氫酶兩點法檢測尿素氮含量，酶法檢測肌酐含量。

1.2.5 檢測腎臟ERK蛋白和mRNA的表達 (1)ERK蛋白(免疫印跡法)：提取腎臟中的總蛋白并定量，蛋白上樣量80 μg；15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉到PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉后加入一抗(β-actin 1∶1 000、pERK1/2 1∶100)4℃孵育過夜，加入二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記，1∶5 000〕室溫搖床孵育，最后使用ECL化學超敏發光液顯影并掃描膠片。Quantity One軟件分析蛋白條帶，ERK蛋白的相對表達水平以ERK蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。(2)ERK mRNA(逆轉錄-PCR法)：按Trizol試劑相關步驟提取腎臟總RNA，鑒定完整性后逆轉錄為cDNA，對cDNA產物進行擴增(PCR引物序列及擴增條件見表1。PCR反應條件：94℃預變性2 min、94℃變性30 s、50～65℃退火30 s、72℃延伸1 min，第二步起循環。取PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像。Quantity One軟件分析顯影條帶，ERK mRNA的相對表達水平以ERK條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值表示。

表1 PCR引物序列及擴增條件

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組血液指標和尿蛋白檢測結果比較 與正常對照組比較，模型組空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，絲膠蛋白組空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組血糖、尿素氮、肌酐和尿蛋白水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組腎臟ERK的表達 與正常對照組大鼠比較，模型組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，絲膠蛋白組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達明顯降低(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 3組腎臟ERK表達比較

1～3：正常對照組、模型組、絲膠蛋白組圖1 各組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達

3 討 論

在機體內復雜的信息傳輸網絡中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路發揮著重要作用〔5〕。ERK是80年代末期發現的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的重要成員，包括ERK1和ERK2，是將信號從細胞表面的受體傳導至細胞核的關鍵。磷酸化激活的ERK1/2由胞質轉位到核內，介導下游因子如Ap-1、c-fos、c-Jun等的轉錄活化，從而參與細胞的增殖與分化、細胞形態的維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞癌變等多種生物學過程〔6〕。

有研究發現，ERK途徑與腫瘤、糖尿病腎病密切相關〔7～9〕。糖尿病腎病是糖尿病微血管并發癥之一，但其發病機制目前尚未完全明了，目前認為系多因素參與，在一定的遺傳背景及部分危險因素的共同作用下致病。有研究證實，高糖和血管緊張素(Ang)Ⅱ是糖尿病腎病的主要致病因子〔7，10,11〕。正常情況下ERK定位于細胞質，高糖和AngⅡ可導致腎小球系膜細胞ERK轉位至細胞核從而被激活，活化后調節核內轉錄因子活性致系膜細胞肥大，而系膜細胞增生、肥大是糖尿病腎病的主要病理表現之一〔12〕，但糖尿病腎病時ERK具體的激活機制尚不完全清楚。本研究也證實了上述研究結果，糖尿病模型大鼠血糖、腎臟ERK的表達明顯升高，腎臟功能明顯降低。

糖尿病腎病一般起病隱襲、進展緩慢，當發展為持續性蛋白尿時較多患者亦無明顯癥狀，隨著腎臟損害的進一步加重，將逐漸出現腎功能損害(如血肌酐、尿素氮等指標升高)、腎性高血壓、水腫等，最后病情進展至晚期可出現嚴重腎衰竭、尿毒癥，是糖尿病患者死亡的主要原因之一〔13〕。有研究證實，改善多種危險因素可明顯延緩糖尿病腎臟損害的進展，改善患者的生存質量。鑒于化學合成藥物的毒副作用，學者們一直在探尋能有效降低血糖且毒副作用輕或無的天然藥物。絲膠蛋白是高分子水溶性蛋白，占蠶繭的25%～30%，我國自古就有蠶繭泡水降血糖的驗方。本課題組前期研究顯示，絲膠能有效降低2型糖尿病模型大鼠的血糖〔14〕。本研究結果顯示，絲膠蛋白可明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖、腎臟ERK蛋白和mRNA的表達，而且反映腎功能的指標如24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的含量也明顯降低。因此，本研究提示，絲膠可能通過降低血糖影響腎臟ERK的激活，從而減輕ERK介導的腎小球系膜細胞增生、肥大，進而改善腎臟功能。絲膠是天然物質，可避免化學合成藥物帶來的毒副作用，因此，絲膠在治療糖尿病腎病及其他糖尿病并發癥方面的作用有待深入發掘。