6-姜辣素對人乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

于杰濱 邵明舉

(山東大學第二醫院急診科，山東 濟南 250033)

乳腺癌約占所有女性腫瘤的25%，每年約有100多萬女性新診斷為乳腺癌，其中有50萬人會死于乳腺癌〔1〕。手術、化療、內分泌治療及放療仍作為目前治療乳腺癌的主要方法，但這些治療手段并不能完全有效地對抗乳腺癌。此外，放化療及激素治療通常會伴隨一些不可耐受的副反應〔2〕。目前，在天然中草藥中尋找具有抗癌效果的小分子已成為腫瘤藥物研發的重點〔3〕。生姜，最初起源于東南亞地區，隨后被引入世界多地種植，其作為日常生活中的調味品和中藥已有幾千年的歷史〔4〕。6-姜辣素作為生姜的主要成分，現代藥理學已證實其具有抗氧化活性、抑制血小板聚集、保護胃黏膜等功效〔5〕。近年來，已有研究發現其在宮頸癌、結直腸癌、肺癌、骨肉瘤中具有抗癌效果〔6～9〕。6-姜辣素發揮抗癌效果主要通過誘導腫瘤細胞凋亡、發揮細胞毒性、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤轉移等發揮作用〔10〕。雖然報道6-姜辣素可以抑制乳腺癌細胞進展，但未對其具體機制深入研究。本文旨在探究6-姜辣素對乳腺癌增殖和凋亡的影響，并探究其內在分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購于中國科學院昆明細胞庫；DMEM和RPMI1640培養基購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于以色列BI公司；6-姜辣素和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8細胞增殖和活性檢測試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術公司；一抗抗體促凋亡蛋白(Bad)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)均購于CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自沈陽萬類生物有限公司；二抗購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 細胞培養 人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231分別培養于改良伊格爾培養基(DMEM)和RPMI1640培養基(包含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)中，并放置于含5%CO2及飽和濕度的細胞孵育箱中37℃培養，每2～3 d給予換液，當細胞長至90%左右，用0.25%胰酶消化離心并重懸，后種于新的培養皿中。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數期生長的MCF-7和MDA-MB-231細胞種于96孔板，每孔5 000個，于培養箱中培養，待4～6 h后細胞貼壁，加入不同濃度6-姜辣素處理(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)乳腺癌細胞24 h，選擇60 μmol/L 6-姜辣素分別處理24、36、48 h,每個處理組設置5個復孔。結束后，將舊培養基棄掉并更換為新的完全培養基100 μl/孔，同時加入CCK-8 10 μl，培養箱孵育2 h后使用酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231以1×106/孔的濃度種于6孔板內，加入0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L的6-姜辣素處理24 h，隨后用胰蛋白酶消化離心并收集細胞，用提前預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入200 μl結合緩沖液，調整細胞密度至1×106/ml，取100 μl緩沖液至流式管內，分別加入5 μl 的Annexin V-FITC和PI，混勻后于室溫避光孵育15 min，加入結合液后應用流式細胞儀分析凋亡率。

1.5 Western印跡法檢測蛋白表達水平 將長至80%～90%的乳腺癌細胞以不同濃度的6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理24 h，隨后用PBS沖洗3次，加入細胞裂解液靜置5 min后用刮勺將細胞刮下并收集到1.5 ml EP管內，于冰上放置10 min使其充分裂解，后在4℃離心機中離心15 min，轉速15 000 r/min。將上清轉移至新的EP管內，并加入1/4體積的5×上樣緩沖液于100℃煮沸5 min使其變性。剩余蛋白取5 μl使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。取30 μg蛋白使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白分離及轉膜，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入目的抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，后加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，使用ECL顯影液顯影。

1.6 統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1 6-姜辣素抑制人乳腺癌細胞增殖能力 使用不同濃度6-姜辣素(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)分別處理乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231各24 h，及60 μmol/L 6-姜辣素分別處理24、36、48 h，利用CCK-8檢測腫瘤細胞增殖能力，結果顯示與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素對乳腺癌細胞具有明顯抑制作用(P<0.05,P<0.01)，并且該抑制作用呈時間和濃度依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01,P<0.001)。見表1，表2。

表1 不同濃度6-姜辣素中MCF-7、MDA-MB-231存活率(%)

與對照組相比:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001,下表同

表2 不同時間60 μmol/L 6-姜辣素中MCF-7和MDA-MB-231存活率(%)

2.2 6-姜辣素促進乳腺癌細胞凋亡 在MCF-7細胞中，對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)細胞凋亡率為(4.42±1.12)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素處理組細胞凋亡率分別為(27.39±2.32)%和(41.85±5.08)%，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差異均有統計學意義(P<0.001)。人乳腺癌細胞MDA-MB-231中，對照組細胞凋亡率為(5.03±0.92)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素處理組細胞凋亡率分別為(30.45±1.37)%和(47.33±3.63)%，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差異均有統計學意義(P<0.001)。

2.3 6-姜辣素影響凋亡相關蛋白的表達 使用不同濃度6-姜辣素〔對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L〕處理乳腺癌細胞系24 h，利用Western印跡檢測促進凋亡蛋白Bad、Bax及抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達。結果顯示，MCF-7細胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表達水平依次為24%、46%、74%，Bax表達水平依次為13%、26%、35%，Bcl-2表達水平依次為91%、74%、52%。MDA-MB-231細胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表達水平依次為11%、18%、27%，Bax表達水平依次為7%、14%、24%，Bcl-2表達水平依次為42%、26%、9%。MCF-7細胞，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促進Bad、Bax的表達，抑制Bcl-2的表達，差異具有統計學意義(圖 2A)；在MDA-MB-231細胞中，可以得到相同的結果，差異具有統計學意義(圖 2B)。

2.4 6-姜辣素通過AMPK/mTOR信號通路影響乳腺癌細胞增殖和凋亡 選用MCF-7和MDA-MB-231細胞系，使用不同濃度6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理24 h，利用Western印跡檢測p-AMPK和p-mTOR的表達。結果顯示,MCF-7細胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表達水平依次為21%、43%、67%，p-mTOR表達水平依次為41%、17%、9%。MDA-MB-231細胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表達水平依次為11%、24%、38%，p-mTOR表達水平依次為56%、27%、14%。與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促進MCF-7(圖 3A)和MDA-MB-231(圖 3B)細胞p-AMPK的表達，抑制p-mTOR的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示6-姜辣素可以激活AMPK/mTOR信號通路。

1～3：0、40、60 μmol/L 6-姜辣素；下圖同圖2 6-姜辣素影響凋亡相關蛋白表達(Western印跡)

圖3 6-姜辣素激活AMPK/mTOR信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡(Western印跡)

3 討 論

乳腺癌通常伴隨較高的發病率和死亡率。手術聯合輔助治療仍然是目前乳腺癌的主要治療策略。此外，分子靶向治療也已漸漸應用在臨床上了。但是在治療侵襲性乳腺癌時，化療耐藥和藥物毒性反應通常是導致治療失敗的主要原因。因此，尋找一種能特異并高效殺死乳腺癌細胞的藥物顯得尤為迫切。

在中國，生姜用來治療頭痛、鼻塞、感冒已有2 500年歷史了，而在一些西方國家生姜最早被用來治療關節炎、風濕病和肌肉不適。除此之外，目前已有研究證實生姜具有抗癌功效。一項流行病學調查顯示，由于日常飲食中含有大量生姜，東南亞國家的結腸癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和其他腫瘤的發病率明顯低于一些西方國家〔11〕。生姜主要包括揮發油、姜辣素及二苯基庚烷等三種成分，其中關于姜辣素的研究迄今已有100多年的歷史。早在二十世紀90年代，Unnikrishnan就發現姜辣素在體外可以抑制淋巴瘤細胞，但未對其機制做出解釋。隨后Lee等〔12〕研究證實姜辣素可以通過誘導凋亡抑制人腫瘤細胞增殖。既往已有研究報道，6-姜辣素通過活化p53誘導凋亡進而抑制子宮內膜癌細胞增殖〔13〕。本研究結果提示6-姜辣素可以誘導乳腺癌細胞凋亡。

AMP激活的蛋白激酶AMPK是一種存在于真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞能量代謝的調節器，激活AMPK可以調節細胞增殖、凋亡、自噬等多種生命活動〔14,15〕。AMPK激活后可以抑制其下游底物mTOR，進而抑制蛋白合成和腫瘤生長。本研究結果提示6-姜辣素激活AMPK/mTOR信號通路。