載基因磁性脂質微泡的制備及對人HepG2細胞的生長抑制作用研究*

李華梅，景香香，劉元稅

（海南省人民醫院，海南 海口 570311）

近年來，隨著醫學分子影像學的發展，靶向超聲 微泡在超聲分子顯像及治療中的研究和應用愈來愈受到學者們的廣泛關注。本研究在脂質微泡中負載磁靶向納米粒子并攜帶基因，研制出一種新型的載基因磁性脂質微泡，這樣既可以在外加磁場的作用下實現基因的靶向高效定位釋放，又可以利用磁性粒子的磁感應升溫特性對腫瘤細胞進行熱療，為今后實現該磁性脂質微泡用于腫瘤的聯合治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、PEI、DSPC、DPPE（美國Sigma公司），SF6氣體、吐溫80、甘油、丙二醇、pEGFP-C1（4.7 kb）、Fe3O4磁性納米粒子（海南省人民醫院中心實驗室制備并儲存），PLXSN質粒、Ecoli DH5Q和人肝癌細胞系HepG2（海南省人民醫院中心實驗室儲存）。

1.2 儀器

能譜儀（Thermo NORAN,vantage,美國），機械振蕩儀（重慶影像研究所），SPG-06A高頻磁感應加熱設備（深圳雙平高頻加熱器廠），掃描電鏡（日本JEOL JsM-6360LV），流式細胞儀（FACS vantage SE 型,美國Becton-Dickson制造），激光粒度分析儀（英國MALVERN公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 載基因磁性脂質微泡的制備將 3 種有機磷脂按一定比例充分溶解于有機溶劑中，加熱30 min使有機溶劑蒸發完全，將葡萄糖和丙二醇按比例配置的水合液加入西林瓶中，超聲分散后使其形成脂質懸液。在此懸液里先加入一定量的PEG4000和吐溫800.01 ml后，將一定量DNA/PEI/Fe3O4和明膠按比例加入到脂質懸液中，用注射器充入定量的SF6氣體置換西林瓶上方的空氣。將西林瓶放入機械振蕩器中振蕩60 s，即得載基因磁性脂質微泡。

1.3.2 磁性脂質微泡體外升溫實驗以 PBS 溶液配制出Fe3O4濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 g/L等4種磁性脂質微泡溶液，各取5 ml入平底試管（20 mm）中，以20℃為起始溫度，置于輸出電流30 A、頻率230 kHz的SPG-06A高頻磁感應加熱設備加熱1 h。每5 min測1次溫度，以時間為橫坐標、溫度為縱坐標繪制磁性脂質微泡的升溫曲線[1]。

1.3.3 轉染效率的觀察轉染之前，預先將質粒 DNA和PEI-Fe3O4分別用無血清培養基稀釋，然后按每孔中加入4 μg質粒DNA的量，按照磁性納米粒子與質粒DNA的比率（固定質粒DNA的質量）分別加入不同量的 PEI-Fe3O4（15 g/L），最后總體積為 400 μl。接著，將復合物置于室溫下孵育30 min，將此混合物加入脂質原溶液中搖振，制備出載基因磁性脂質微泡。將HepG2細胞接種于6孔板中，5×105個/孔細胞，孵育18 h后，用2 ml無血清1640培養基替換原來的細胞培養基，其中含有按照不同比率配制的500 μl PEI-Fe3O4/pEGFP載基因磁性脂質微泡（A組），置于強磁鐵上30 min，然后，用新鮮的含有血清的培養基替換無血清的培養基，繼續孵育24 h。以裸DNA（B組）和明場圖（C組）作為轉染的對照。熒光顯微鏡下觀察細胞熒光蛋白的表達情況。

1.3.4 載基因磁性脂質微泡基因治療聯合磁流體熱療對HepG2細胞生長的影響MTT方法測定細胞增殖率，取對數生長期HepG2細胞并吹打成細胞懸液，細胞濃度調整為4×104個/ml，按每孔100 ml接種于96孔板，每組5個接種復孔，接種細胞24 h后，隨機分為4組，1組加入1640培養液，2組加入磁性脂質微泡，3、4組加入載基因磁性脂質微泡，其中2、4組聯合MFH板置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h，給定輸出電流30 A，交變磁場為4 kW，兩板置于飽和濕度培養箱中繼續培養 48 h，每孔加入 MTT 20 pl，以相同條件繼續培養4 h后棄去孔內液體，加入溶液150 μl DMSO/孔，搖勻10 min。讀取酶標儀上493 nm處光密度（OD）值，取得細胞增殖率[2]。各組細胞存活率計算公式：實驗組OD均值/對照組OD均值×100%）。

流式細胞儀的測定，取對數生長期的HepG2細胞吹打成細胞懸液，將其濃度調整為3×105個/ml后接種于培養瓶。4個實驗組共接種4個培養瓶，24 h后按分組情況分別加入1640培養液（1組）、磁性脂質微泡（2組）、載基因磁性脂質微泡（3組）、載基因磁性脂質微泡（4組），其中2、4組置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h，給定交變磁場4 kW，輸出電流30 h，4瓶細胞置于飽和濕度的培養箱中培養48 h。檢測前將 PBS 洗滌 2 次的細胞重懸于 0.5 ml PI染色液（20 mg/ml，0.25 mg/ml RNase A）中于室溫下避光染色30 min，用目絲網過濾后上機分析。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗和χ2分割法，χ2分割法檢驗水準為α=0.0083，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 磁性脂質微泡造影劑的表征

所制磁性脂質微泡掃描電鏡下似圓球形，平均粒徑為1 127 nm，分散度好（見圖1）。表面能譜分析示磁性脂質微泡中P為脂質成分，Fe、O為磁性材料的成分（見圖2）[1]。

圖1 磁性脂質微泡掃描電鏡圖

圖2 磁性脂質微泡的能譜分析

2.2 磁性脂質微泡體外升溫實驗結果

磁場強度恒定條件下，磁性脂質微泡升溫能力與Fe3O4磁性納米粒子濃度呈正相關，但有共同規律：前30 min升溫快速，30～ 50 min升溫平緩，50 min 后恒定于42～62℃（見圖3）。

圖3 不同濃度Fe3O4磁性脂質微泡磁感應升溫曲線

2.3 轉染效率

pEGFP-C1/PEI/Fe3O4載基因磁性脂質微泡轉染HepG2細胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達（見圖4）。

圖4 熒光顯微鏡下HepG2轉染效率的觀察 （×200）

2.4 載基因磁性脂質微泡基因治療聯合磁流體熱療對HepG2細胞生長的影響

2.4.1 MTT實驗結果 各組 HepG2 細胞相對增殖率比較，差異有統計學意義（χ2=16.481，P=0.001）。2、3、4組對肝癌細胞HepG2增殖均有抑制作用，且4組對HepG2細胞增殖的抑制作用高于2、3組。見圖5。

圖5 載Wtp53基因磁性脂質微泡對HepG2的生長抑制作用

2.4.2 流式細胞儀檢測結果各組 HepG2 細胞經處理48 h后，流式細胞術分析顯示：2、3、4組在細胞周期G0期前細胞周期均被不同程度地阻滯在S或G/M期，且出現亞二倍體凋亡峰。1組凋亡率為0.28%，2組凋亡率為16.13%，3組凋亡率為20.05%，4組凋亡率為42.93%，各組凋亡率比較差異有統計學意義（χ2=46.835，P=0.000），2組與3組凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.0083），2組與4組、3組與4組凋亡率比較差異有統計學意義（P＜0.0083）。見圖6。

圖6 載Wtp53基因磁性脂質微泡處理細胞后的流式細胞圖

3 討論

超聲微泡經歷了從普通微泡到靶向微泡的發展階段，現階段，在磁性脂質微泡的表面進行修飾[3]或在其內部進行負載，使其成為藥物和基因的靶向載體，制備出兼具靶向診斷和治療的磁性脂質微泡成為研究熱點。

超聲微泡用于包裹氣體的殼膜材料主要是體內可生物降解的高分子多聚物[4-5]、脂質[6]或白蛋白[7]，為了便于微泡攜帶更多抗體和多肽等配體[8-9]，可通過調節殼膜材料的脂質配比或是適當配比輔料來對微泡表面進行修飾。超聲微泡的氣體核心多采用氟碳氣體（如C6F）或氟硫氣體（如SF6），其優點為彌散度低、血液溶解度低。本室成膜材料選擇有機合成磷脂，膜內填充SF6氣體，采用機械振蕩法制備磁性脂質微泡，經反復驗證，確定振蕩頻率為4 500 r/min，即可使微泡粒徑＜2 μm，能經血液循環順利到達病變部位，不易導致肺栓塞。

超聲微泡不僅用于制備影像增強劑來提高圖像對比度，同時也可作為靶向基因載體來攜載基因。為了賦予普通微泡磁靶向性和磁感應升溫特性且又可作為基因載體，筆者采用一定技術將進行表面修飾的磁性納米粒與PLSN-53質粒結合后混入脂質原溶液中一起搖振，即制備出載基因磁性脂質微泡。

研究者將磁性脂質微泡作為一種安全、便捷的載體[10-11]，其表面或內部攜載的基因或藥物能夠靶向釋放，從而達到治療疾病的目的。基因的有效轉染是基因治療成功的關鍵。HALLOW等[12]的研究表明，微泡作為一種空化核，在超聲輻照下可產生瞬時空化，升高局部組織和毛細血管細胞膜的通透性，促成聲孔形成。另外有學者研究亦表明[13]，超聲作用微泡產生的空化效應使其攜載的藥物和基因得到高效利用，達到良好的靶向治療效果。SAKAKIMA等[14]研究發現，超聲輻射聯合磁性脂質微泡轉染細胞可使轉染效率提高近6倍。LENTACKER等[15]制作的攜帶質粒DNA微泡可提高人肝癌細胞轉染效率，明顯抑制肝癌細胞的生長。QIU等[16]利用超聲輻照下，微泡聲空化效應介導EGFP基因轉染兔肌腱，結果證實EGFP基因在兔肌腱中得到持續高表達。

本研究創新性地將具有高熱穩定性、良好的水溶性和較大的生物相容性的磁性納米粒子引入超聲微泡，旨在賦予普通微泡磁靶向性的同時，使微泡對腫瘤組織兼具基因治療和磁感應熱療[17]的特性。本實驗交變磁場中包有磁性納米粒的脂質微泡懸浮液溫度上升后穩定在42～62℃，該區間溫度對腫瘤熱療具有良好效果。因此，可以利用不同濃度磁性脂質微泡在一定磁場下的升溫恒溫來實現對腫瘤的熱療[1]。

本研究制備的磁性脂質微泡不僅具有磁場的靶向性，同時可作為一種新型的磁流體和基因的載體，對腫瘤進行磁感應熱療和基因治療，有望成為靶向腫瘤治療的新途徑。