回陽固元方對人乳頭瘤病毒感染細胞凋亡的影響研究*

曹萍，朱偉，楊同華

（1.云南省第一人民醫院 皮膚科，云南 昆明 650032；2.昆明理工大學，云南 昆明 650504）

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是一種小分子DNA病毒，容易吸附在人體皮膚及黏膜誘發疾病。尖銳濕疣（condyloma acuminatum,CA）是由HPV感染引起的生殖器皮膚增生性疾病，也是性傳播疾病的一種，其發病率在我國性傳播疾病中位居前列，在性接觸較高的歐美國家，其發病率更高。因此，CA受到全球學者的廣泛關注[1-2]。

回陽固元方由回陽飲演化而來，回陽飲為清代四川名醫鄭欽安治療下元虧損而設，以此為基礎，云南省已故著名溫陽大家吳附子吳佩衡先生創制大回陽飲[3]，臨床上對多種中西醫難治的疾病療效頗佳。該方含附子、干姜，附子為第一溫陽藥，國內知名的溫陽大家吳附子吳榮祖先生繼續發展為回陽固元方，對包括CA在內的難治性疾病的療效有很大提高。本研究用不同濃度的回陽固元方，探討該方的扶正作用對HPV感染細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

標本皮膚組織取自云南省第一人民醫院皮膚科CA患者局部切除的皮損（HPV感染組）。正常組皮膚組織為本院泌尿外科正常人包皮切除組織。器材一次性塑料培養瓶、培養板及塑料凍存管2 ml（美國Corning公司），常規手術器械（淮安市醫療用品廠），0.22 μm微孔濾器（美國Millipore公司），熒光定量PCR儀 CFX96（美國BIO-RAD公司），超凈工作臺（蘇凈集團州安泰空氣技術有限公司），5%二氧化碳CO2細胞培養箱（美國Heraeus公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），酶標儀（奧地利Clini Bio公司），直徑10 cm細胞培養瓶和96孔培養板（美國Falcon公司）；流式細胞儀FACS Calibur（美國 Becton Dicknson 公司）。

胰酶、PBS、青鏈霉素（以色列BI公司），熒光定量PCR試劑盒：CWBIO CW09570，RNase（美國Sigma公司），胰酶抑制劑、限制性角質形成細胞無血清培養基（美國Gibco公司），DispaseⅡ（瑞士ROCHE公司）。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB）、蘇木精、細胞角蛋白（廣譜）CK（Pan）、鼠抗人單克隆抗體及二抗生物素標記的兔抗鼠IgG（福州邁新生物技術開發有限公司）。Caco-2細胞購置于中國科學院昆明細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 CA 患者皮損處角質形成細胞的分離與培養、細胞形態學觀察及鑒定、細胞周期的檢測參照文獻[4]。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡對于貼壁細胞，可將細胞直接接種于蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。將回陽固元方不同藥物濃度作用后的角質形成細胞采用細胞爬片的形式生長于蓋玻片，誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；取出蓋玻片然后用PBS沖洗細胞2次，沖洗過程中不宜過于激烈以免沖走細胞；在500 μl緩沖液中加入5 μl磷脂結合蛋白（Annexin V-FITC），5 μl碘化丙啶（propidium lodide,PI）混勻 ；將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋、避光，室溫反應5 min。將蓋玻片倒置于載玻片，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和羅丹明）觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。檢測的細胞凋亡結果中，UL區為壞死細胞區，LL區為細胞存活區，LR區為早期凋亡區，UR區為晚期凋亡區，細胞凋亡率=（LR+UR）/LL，以此統計不同濃度、時間段的細胞凋亡率。

1.2.3 人結腸癌上皮細胞Caco-2 模型的建立 將Caco-2細胞接種于轉運池（Transwell）中的微孔濾膜上可形成單層細胞層，是用來模擬小腸上皮細胞層的吸收模型，該濾膜可由硝酸纖維素或者多聚碳酸酯制成。由于多聚碳酸酯膜不會形成藥物擴散過程中的屏障，所以常選用多聚碳酸酯膜作為細胞單層模型的支架。取出冷凍的Caco-2細胞于37℃水浴鍋中快速融化，用吸管吹打成單細胞懸液，轉入15 ml離心管中，加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM（高糖）培養基，混勻后 1 200 r/min離心5 min，棄上清液，再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，充分吹打成單細胞懸液，再混勻后1 000 r/min離心 5 min，棄上清液，加入適量含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基重懸，吹打，調整細胞密度在2×105～5×105個/L左右，然后接種于 TranswellTM細胞培養皿中（2 ml/孔），共6孔，在培養皿的下腔加入1 ml的DMEM培養基，放入37℃、5% CO2濕度為90%的培養箱中培養。第2天取出細胞，顯微鏡觀察細胞的生長貼壁情況，棄出舊培養基，并加入新鮮培養基，然后拍照記錄，以后培養過程中每隔1天更換1次培養基，并持續觀察細胞生長狀。結果表明，Caco-2細胞約在接種后1周長至培養皿的70%～80%，再持續培養才可以長滿至整個培養皿。通過對Caco-2細胞長滿后每個孔的觀察，結果發現細胞融合成完整的細胞層，細胞間連接緊密；該細胞形態與小腸上皮細胞極為相似，從形態學上可以確定所培養細胞為Caco-2細胞，細胞單層膜完整性較好，可用于藥物吸收的轉運實驗。

1.2.4 回陽固元方的制備回流提取法在應用乙醇等易揮發的有機溶劑作為溶媒提取中藥中有效成分時，為減少溶媒的使用量和溶媒的消耗，而采用加熱提取，是使溶媒揮發冷卻后重新回流至鍋內的一種方法。秤取制附子 20g，干姜 15g，肉桂 10g，炙甘草 15g，麻黃10g，細辛3g，將秤取好的中藥材加工成細段或者粗粉放入多功能提取罐中，加入5倍量蒸餾水浸泡30min，用夾層蒸汽加熱，并及時打開冷凝器的冷卻水，沸騰時要先排除罐內空氣，否則會使鍋內帶壓，再關閉排氣閥。60min后收集濾液，將濾液回流抽提30min，過濾，加入3倍量的蒸餾水回流抽提30min，過濾，低溫低壓濃縮成 1g/ml的提取液共 50ml，經 3500 r/min 離心5min，離心 3 次，再以 13000 r/min 離心 5min，離心3次，最后用0.45μm濾膜過濾，4℃密封無菌保存，使用前再用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。經回流抽提得到回陽固元方的濃縮液，低溫低壓再濃縮成1g/ml的提取液，稀釋成5個濃度梯度，分別是5、10、20、40及80μg/ml。作用于目標細胞時分5個時間段，分別是12、24、48、72及96h，然后測得不同中藥濃度和不同時間段的細胞指標。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，對數據進行方差齊性檢驗（ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CA皮損處角質形成細胞

正常組皮膚組織獲得的單細胞懸液，在光學顯微鏡下可見細胞呈典型的上皮樣特征，呈鋪路石狀，細胞核較大，且可見含有多個細胞核的細胞，細胞質內含有較多顆粒，細胞排列緊密折光性較好。CA皮損處角質形成細胞培養制成的單細胞懸液，細胞形態無鋪路石狀，細胞近似圓形，可在體外穩定培養。見圖1、2。

2.2 Caco-2細胞

Caco-2細胞形態呈不規則狀，細胞排列緊密，具有微絨毛結構，類似于小腸上皮細胞。Transwell（轉運池）建立，Caco-2細胞培養于多聚碳酸酯膜上，排列緊密后使藥物透過Caco-2細胞層作用于目標細胞或者收集透過后的濾液無菌保存，供后續實驗使用。見圖3、4。

2.3 細胞凋亡

經HPV感染的角質形成細胞其凋亡率有所降低。見圖5、6。

圖1 正常角質形成細胞 （×200）

圖2 CA 皮損角質形成細胞 （×200）

圖3 Caco-2 細胞 （×200）

圖4 Transwell （轉運池）

固定48h后，不同藥物濃度HPV感染角質形成細胞的凋亡率比較，差異有統計學意義（F=159.932，P=0.000），隨著中藥濃度的增加，凋亡率逐漸增加；固定藥物濃度20μg/ml后，不同作用時間HPV感染角質形成細胞的凋亡率比較，差異有統計學意義（F=140.794，P=0.000），隨著時間的增加，角質形成細胞的凋亡率逐漸增加。見表1、2。

圖5 正常角質形成細胞凋亡

圖6 感染角質形成細胞凋亡

表1 48 h不同藥物濃度HPV感染角質形成細胞的凋亡率

表2 20 μg/ml不同作用時間HPV感染角質形成細胞的凋亡率

3 討論

角質形成細胞受損可引起多種疾病，而CA是其中較嚴重的一種，目前其根除性治療仍是臨床中的一大難題[5]。在CA的發病過程中，角質形成細胞出現諸多變化，如何調整角質形成細胞的細胞周期是解決CA治療的關鍵所在[6]。1975年RHEINWALD和GREEN[7]首次在體外成功培養角質形成細胞，該里程碑式的成就為人類修復皮膚缺損奠定基礎。1981年O'CONNOR培養適于移植的人自體表皮細胞膜片[8]，為體外構建組織工程皮膚及臨床應用提供重要的實驗依據。但是關于角質形成細胞周期的研究甚少，如何闡述細胞周期與CA的發生、發展的相關性，是未來研究CA治療的趨勢。本研究發現，CA皮損處角質形成細胞在培養過程中易受白假絲酵母菌的污染，連續傳代及反復凍融都會破壞其細胞固有的生物學特性[9]。在檢測CA發病前后角質形成細胞周期及細胞增殖能力發現，感染HPV后的角質形成細胞其周期縮短，導致細胞的增殖能力增強，使感染者快速出現皮損。臨床中常用直接去除疣體的辦法來治療CA，但治標不治本，CA仍有較高的復發率。宿主局部免疫抑制和對HPV蛋白的異常識別導致的病毒免疫逃逸和持續感染是HPV感染相關疾病難以根治的主要原因[10]。

關于CA的中醫治療，國內外研究得不多[11]，而且幾乎是以清熱除濕祛邪為主，扶正固本者較少，中醫抗HPV感染的治療應抓住主流本質。本課題用極富云南特色的回陽固元方來誘導馴化HPV感染的角質形成細胞，利用人結腸癌上皮細胞Caco-2模型模擬人體小腸上皮細胞[12]，類似人體內環境，更接近于中藥的體內吸收過程。通過測定中藥作用后CA皮損角質形成細胞的凋亡率發現，隨著作用時間和中藥濃度的增加，角質形成細胞的凋亡率呈逐漸增加的趨勢，說明回陽固元方的扶正作用可誘導馴化患者皮損處的角質形成細胞，促使其細胞凋亡。

CA的發病機制尚不清楚，深入研究其發病機制對與皮損角質形成細胞有關的皮膚病有著重要的理論和實踐意義，提示可以從細胞凋亡的途徑來治療相關的皮膚病，為其治療開辟新的領域。