黑豆抗氧化肽的酶解條件優化及分級制備

田 地，任 健

(1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省玉米主食工業化工程技術研究中心， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黑豆主要產于中國、日本、韓國、美國等國家。由于黑豆具有耐旱、耐瘠、適應性廣、營養價值高等特點，在我國的大部分地區都有栽培，以東北產量最多[1]。研究表明[2]，黑豆蛋白質含量比黃豆高24.5%，相當于雞蛋的3.38倍。黑豆蛋白的氨基酸組成與動物蛋白相似，含有18種氨基酸，必需氨基酸占氨基酸總量的40%以上，符合FAO/WTO均衡模式標準[3]，能滿足人類強體益智的需求。

超濾是一種新型生物分離技術，具有操作簡單、易于放大等優點，目前已被廣泛應用于蛋白質和多肽的分離[4-6]。作為一種膜分離方法，通過壓力差的推動可選擇性地將溶液中較大溶質分子截留于微孔濾膜上[7]。將超濾技術應用于蛋白肽的分離純化，有利于提高肽的生理活性。田少君等[8]發現相對分子質量小于3 kDa的小分子大豆肽具有較高的自由基清除率。張宇昊等[9]發現經超濾分離后，相對分子質量小于1 kDa的花生短肽降血壓活性很強。周麗珍等[10]采用先超濾后納濾聯用工藝制備的花生短肽液具有較強的ACE抑制活性和體外抗氧化活性。

本試驗以黑豆分離蛋白為原料，利用Alcalase對其進行酶解，得到制備抗氧化肽的最佳酶解條件，隨后利用超濾法對所得酶解產物進行分離，探究不同相對分子質量組分的抗氧化性，為擴大黑豆分離蛋白在食品工業中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

黑豆，購于黑龍江省齊齊哈爾市；Alcalase(酶活力≥20萬U/g)，上海寶曼生物科技有限公司；水楊酸，分析純，天津市科密歐化學制劑有限公司；DPPH，分析純，上海生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

ZNCL-GS智能磁力攪拌器；TU-1810型紫外可見光分光光度計；PB-10型酸度計；323E型膜過濾系統，瑞典。

1.2 試驗方法

1.2.1 Alcalase酶解黑豆分離蛋白

參照王小慶等[11]的方法提取黑豆分離蛋白。以黑豆分離蛋白為底物配制一定質量分數的蛋白分散液，放入磁力攪拌器中水浴至試驗所需的溫度，調節pH至9.5，加入Alcalase并攪拌。反應過程中以1 mol/L NaOH維持pH恒定。酶解至預定時間后，將酶解液置沸水浴中滅酶10 min，冷卻后于4 000 r/min條件下離心15 min，所得上清液即為黑豆分離蛋白酶解液。

1.2.2 超濾法分離黑豆分離蛋白酶解產物

黑豆分離蛋白酶解液依次采用10、5 kDa和3 kDa截留相對分子質量的超濾膜進行超濾，得到大于10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa及小于3 kDa的組分，測定各組分的抗氧化性。

1.2.3 水解度(DH)的測定

采用pH-stat法測定酶解產物的水解度[12]。

1.2.4 抗氧化性測定

(1)羥基自由基(·OH)清除率：參照Fenton反應方法建立反應體系模型[13]。取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產物，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵、2 mL6 mmol/L的雙氧水，混勻后靜置10 min，加入2 mL6 mmol/L的水楊酸，振蕩混勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光值，記為Ai，用去離子水替代水楊酸測定的吸光值記為Aj，空白對照組以去離子水代替樣品，測定的吸光值記為A0。按下式計算·OH清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)DPPH自由基清除率：參照Zhang等[14]的方法測定。取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產物，加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，混勻，避光反應30 min后，在517 nm處測定的吸光值為Ai；另取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產物，加入無水乙醇2 mL，避光反應30 min后，在517 nm處測定的吸光值為Aj；以2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇作參考，避光反應30 min后，在517 nm處測定的吸光值為A0。按下式計算DPPH自由基清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)還原力(OD值)測定：取2 mL 2 mg/mL的樣品溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液、2 mL鐵氰化鉀溶液，均勻混合，在50℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后離心。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL三氯化鐵溶液，振蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在波長為700 nm下進行比色。以去離子水代替樣品重復以上操作，作為空白。還原力以OD值表示。

2 結果與討論

2.1 Alcalase酶解黑豆分離蛋白單因素試驗

2.1.1 加酶量的確定

配制質量分數4%的黑豆分離蛋白分散液，在酶解溫度50℃、酶解時間100 min、pH 9.5條件下，分別選擇加酶量為1%、2%、4%、6%、8%進行酶解，測定酶解產物的抗氧化性(·OH清除率)及水解度，結果見圖1。

注：不同字母代表差異顯著，p<0.05。下同。圖1 加酶量對酶解產物的水解度和抗氧化性的影響

由圖1可知，加酶量達到4%之前，隨著加酶量的增加，蛋白質肽鍵斷裂的速度增加，導致酶解產物的水解度增加，抗氧化性也逐漸增強，當加酶量繼續增大時，水解度并未顯著增加，·OH清除率反而下降。因此，選擇加酶量4%進行下一步試驗。

2.1.2 酶解時間的確定

配制質量分數4%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、酶解溫度50℃、pH 9.5條件下，分別選擇酶解時間為60、80、100、120、140 min進行酶解，測定酶解產物的抗氧化性及水解度，結果見圖2。

圖2 酶解時間對酶解產物的水解度和抗氧化性的影響

由圖2可知，在反應的最初階段，隨著酶解時間的延長，酶解產物的水解度和抗氧化性都增加。當酶解時間達到80 min時，水解度和抗氧化性都較高，分別為27.19%和22.25%。這是因為隨著酶解時間的延長，蛋白質水解生成的肽增加，延長酶解時間，·OH清除率和水解度升高；此后，·OH清除率和水解度都趨于平緩，在統計學上無顯著差異。因此，選擇酶解時間80 min進行下一步試驗。

2.1.3 酶解溫度的確定

配制質量分數4%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、pH 9.5、酶解時間80 min條件下，分別選擇酶解溫度為45、50、55℃進行酶解，測定酶解產物的抗氧化性及水解度，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對酶解產物的水解度和抗氧化性的影響

由圖3可知，酶解溫度為50℃時，酶解產物對·OH清除率達到20.47%，水解度達到25.81%，在酶解溫度高于50℃后，·OH清除率和水解度均無顯著性差異。Alcalase最適溫度在40～55℃范圍內，溫度過高或過低都會影響酶活力。因此，選擇酶解溫度50℃進行下一步試驗。

2.1.4 底物質量分數的確定

配制底物質量分數分別為4%、5%、6%、7%、8%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、酶解溫度50℃、pH 9.5、酶解時間80 min條件下進行酶解，測定酶解產物的抗氧化性及水解度，結果見圖4。

圖4 底物質量分數對酶解產物的水解度和抗氧化性的影響

由圖4可知，在底物質量分數低于5%時，隨著底物質量分數的增加，酶解產物的水解度和抗氧化性增加。根據酶促反應原理[15]，底物濃度較小時，隨著底物濃度的增加，能夠被酶利用的底物增加，此時水解產生的肽段增多，因此·OH清除率升高。而當底物濃度過高時，由于體系濃度過高，使酶與底物的接觸面積減小，蛋白酶無法完全作用于底物，·OH清除率下降。因此，選擇底物質量分數5%進行后續試驗。

2.2 Alcalase酶解黑豆分離蛋白正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以抗氧化性(·OH清除率)為指標，以酶解時間、加酶量、底物質量分數和酶解溫度為考察因素，設計四因素三水平的正交試驗，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

由表2可知，影響抗氧化性的因素主次順序為加酶量>酶解溫度>酶解時間>底物質量分數，各因素水平的最優組合為A1B1C2D2，即酶解時間70 min、加酶量3%、底物質量分數6%、酶解溫度55℃，在此條件下進行驗證試驗，·OH清除率為21.62%。

2.3 超濾對黑豆分離蛋白酶解產物抗氧化性的影響

對上述優化條件下所得的酶解產物經過超濾分級后，測定不同截留相對分子質量的酶解產物的抗氧化性，結果如圖5所示。

圖5 不同相對分子質量組分的黑豆分離蛋白酶解產物的抗氧化性

由圖5可知，超濾處理對黑豆分離蛋白酶解產物的抗氧化性影響較大。與未超濾酶解產物相比，相對分子質量3～5 kDa和小于3 kDa組分的抗氧化性都有明顯增加。尤其是相對分子質量小于3 kDa 的組分，與未超濾酶解產物相比，其·OH清除率由21.62%增加至29.54%，DPPH·清除率由9.06%增加至22.05%，還原力(OD值)由0.362增加至1.298。隨著相對分子質量的減小，體系內短肽鏈逐漸增多，能夠發揮抗氧化作用的端基逐漸暴露出來，因此抗氧化性明顯增強。

3 結 論

Alcalase酶解黑豆分離蛋白制備抗氧化肽的最優條件為：加酶量3%，底物質量分數6%，酶解溫度55℃，酶解時間70 min。在最優條件下酶解產物對·OH清除率為21.62%；酶解產物的超濾分級組分表現出不同的抗氧化性，相對分子質量小于3 kDa的組分抗氧化性最高，·OH清除率為29.54%，對DPPH·清除率為22.05%，還原力(OD值)為1.298。