富油微藻的選育及規模化培養研究進展

黎秋玲，李 志，張慶華，劉孟熒，周智友，李漢廣

(江西農業大學 生物科學與工程學院，江西農業微生物資源開發與利用工程實驗室， 江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，南昌 330045)

傳統生物柴油生產原料主要是各種天然動植物油脂、餐飲及食品工業的廢棄油脂等。與這些生物質相比，微藻具有許多明顯的優勢[1-4]。微藻無需高質量的農業耕地，可利用污水、灘涂地、荒廢地等非耕地進行生長，且生長速度快，脂肪含量高，部分微藻積累了大量可作為生物柴油主要原料的中性脂肪三酰甘油(TAG)，其單位面積油產量是油料植物的數十倍。但微藻在實驗室和工業化培養中存在一定的差異，藻種的生命力(培養密度、育種、穩定性及特定環境中對掠食者的敏感性)隨著環境的變化而變化，一方面規模化培養的微藻藻種僅有螺旋藻(Spirulinasp.)、小球藻(Chlorella)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等[5]，且這些藻種中能用于能源開發的微藻藻種更是少之又少；另一方面在已用于大規模培養的微藻中，油脂占藻體干重的比例仍然處于較低水平。雖然利用微藻生產生物柴油的技術難題已經被成功攻克，但就經濟方面而言，從微藻原料中獲得的生物柴油仍不能與傳統化石燃料相抗衡[6]。在現階段，微藻生物柴油與石化行業相比，并無明顯經濟優勢。因此，要加快發展微藻生物能源技術，提高微藻的油脂含量、選擇合適的規模化培養方式是目前微藻生物質能源必須解決的關鍵問題。本文系統介紹了近年來國內外微藻生物柴油的發展狀況，對優良藻種的選育及常見的規模化培養系統進行闡述，并展望了微藻生物柴油未來發展趨勢和潛在發展前景。

1 微藻生物柴油國內外發展狀況

目前，全球正面臨能源緊張的問題，解決能源危機能夠直接影響全球經濟的可持續發展。1978年起，美國能源部(DOE)實施了微藻等水生生物作為能源原料的計劃[7]。20世紀90年代至21世紀初，日本國際貿易和工業部著手研究的微藻固定CO2能力和封閉式光生物反應器技術，是微藻固碳研究的開端[8]。2017年，日本研究集團Euglena和千代田公司簽署了日本第一個以微藻為原料生產可再生噴氣燃料和柴油燃料試驗工廠的工程采購和建設合同，生產所得能源將在2019年用于航空和公共道路運輸[9]。

微藻生物柴油的研究在我國發展較遲，從無到有，再到現在的小有所成，其中雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的規模化生產突破了產業化中一系列限制性屏障。在產油微藻的研究方面，國內已有水生生物所、武漢植物園等單位開展了藻種的篩選、規模化培養等研究，并與大型石油化工企業進行合作，力求打開適合我國國情的微藻生物柴油產業化大門[10]。

2 優勢藻種的篩選與獲得

微藻的生物量和油脂含量是衡量能源微藻應用價值的兩個重要標準。因此，篩選出優勢藻種是實現微藻產業化生產生物柴油的關鍵因素之一。同時，也是從事微藻生物質能源基礎研究的重要內容。

2.1 物理、化學誘變方法及基因工程篩選

油脂含量較高的微藻藻種主要分布在綠藻門(Chlorophyta)、硅藻門(Bacillariophyta)和金藻門(Chrysophyta)[11]。在農業系統中，微藻需要能夠耐受溫度、光照、鹽度和病原體負荷等變化，才能使藻種在不同區域和季節被廣泛培育。然而，在大規模農業或工業生產中使用的植物都不是野生型，野生型藻種不太可能具有農業或工業生產所需的所有特征[12]。為提高藻種的產油性能，對藻種進行物理、化學誘變以及基因改造是較為常用的手段。

大多數研究表明紫外線(UV)誘變[13]和化學誘變可以改善微藻的生物量或脂質含量。Liu等[14]對小球藻(Chlorella)進行UV誘變，與對照藻株相比，突變藻株的生物量提高了7.6%，脂質含量顯示出不同程度的增加，最大值達到28.1%。Tanadul等[15]利用甲基磺酸乙酯(EMS)對小球藻(Chlorella)進行化學誘變，獲得的誘變藻株脂質含量和脂質產率與野生型相比分別提高了59%和53%。Rismani-Yazdi等[16]重建特氏杜氏藻(D.tertiolecta)中生物燃料前體中與生產有關的代謝途徑，在高鹽濃度培養下，升高的鹽濃度導致細胞總脂質含量增加22%。收獲時微藻脂質含量接近于原始藻株的兩倍，超過細胞干重的35%。Baek等[17]通過對萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因編輯，將藻種一步轉化，改善了藻種的光合生產力。Zhu等[18]利用Hsp70A-RbcS2融合啟動子，在葉酸中與葉綠體轉運肽融合，使微藻的總脂肪酸含量比野生型增加22%，TAG含量增加32%。Ma等[19]通過在mRNA 水平上控制微擬球藻(Nannochloropsissalina)PDK基因(NsPDK)的表達使其體內的酶活性減弱，加快TAG的積累。

2.2 新型微藻篩選方法

為配合藻種的選育，提高篩選的效率和速度，選擇新型微藻篩選方法，可快速篩選出目的藻種。Sung等[20]開發了一種微流體方法，通過簡單操縱微流體裝置中的磁場(91.90%的空白、87.12%的低密度和90.66%的高密度液滴可以分離成不同的出口)，用基于細胞密度的磁力微滴分離具有高生長性能的藻種。Kim等[21]通過使用微流體系統在單細胞水平上對趨光反應進行定量分析，由此將選擇效率顯著提高了8倍以上，并分別提高1.9倍的光自養細胞生長速率和8.1倍的脂質生產力。Hugo等[6]利用熒光激活細胞分選分離出一株有較大孔徑、富含脂質的綠藻(Tetraselmissp. CTP4)。采用兩階段培養方式，其脂質含量占細胞干重的33%，脂質生產力達52.1 mg/(L·d)，并且CTP4的生物質能迅速脫水，可降低生物柴油精煉的下游加工成本，是一種非常有前景的優勢藻種。

3 富油微藻的規模化培養

產油微藻工業化培養中，除了藻種本身油脂含量的重要性之外，能否進行高密度培養也具有重要意義。微藻根據自身不同屬性及對光源和營養成分的需求，可分為光自養、異養、混養三種培養方式[22](見表1)。因此，可結合藻類生活習性和不同培養方式的特點，對光生物反應器進行改良和創新，研發出適合微藻規模化培養的新模式。

表1 不同培養方式的特點[22]

3.1 光自養方式

大多數微藻為光合自養型微生物[23]，其能夠利用光作為能量來源把化學能轉化為生物能。實驗室條件下，利用人工光源的小規模培養難以滿足微藻的產量需求，若想實現微藻的規模化培養，室外培養必不可少[24]。室外培養可分為開放式、封閉式和混合型光生物反應器。

3.1.1 開放式光生物反應器

開放式光生物反應器可以分為自然池塘、人工池、帶攪拌裝置的循環池以及人工制作的開放式光生物反應器。De Bhowmick等[25]在400 L的跑道池中養殖小球藻(Chlorellavariabilis)，測得微藻平均生長率為0.36 d-1，油脂含量(占藻體干重)10%。雖然油脂含量較實驗室條件下培養偏低，但開放式跑道池構建單一、成本較低、便于操作，使其規模化培養的成本降低。為減少開放式光生物反應器易受環境等因素的干擾，可在開放式跑道池上方覆蓋一些透光的物質，以解決夜間熱損失、水汽蒸發、灰塵和昆蟲等污染問題，使之成為封閉池[26]。

開放式跑道池對土地的利用率不高，為了提高土地的利用率，Hu等[27]利用開放式多層光生物反應器對微藻進行培養。藻液通過重力作用在每層反應器間流動，降低藻液流動能耗，同時利用空間延伸減少反應器的占地面積，實現了延長藻液流程及加快液體流速，能夠有效獲得微藻生物質，且所培養微藻的脂質含量達到(占干重)78%。為了克服層式光合反應器上層對下層的光源阻礙，唐偉偉等[28]設計開發了新型多層薄層貼壁光生物反應器裝置，提高螺旋藻(Spirulinasp.)生物量，使其生物量產率最高達到45～60 g/(m2·d)，平均生物量產率達到30.3 g/(m2·d)。

3.1.2 封閉式光生物反應器

封閉式光生物反應器是針對開放式跑道池生物量產率低、易受外界污染和難控制培養條件等問題開發出的反應器結構，采取的方法主要是縮短光程(如薄腔室、細管)以及強化明暗交替[29]。封閉式光生物反應器與開放式光生物反應器比較具有以下優點：①不易受到污染，利于純種的保護；②防止水分蒸發及培養液鹽漬化；③冷卻速度快，呼吸作用的損傷降低；④實現高密度培養；⑤濃度高，降低采收的成本；⑥溫度等外界環境便于控制。

Pereira等[30]把綠藻(Tetraselmissp. CTP4)的培養擴大到100 m3的工業規模的管狀光生物反應器(PBR)中，CO2平均減緩效率為65%，生物質與碳的比率為1.80，使CTP4具有良好的生物量生產力和光合能力。

在商業規模上，微藻的培育主要集中在封閉的管狀光生物反應器上，但這些光生物反應器對土地有巨大的需求，并且構建和操作昂貴。然而，垂直柱式反應器如氣升式光生物反應器，構造便宜、操作簡單、結構緊湊，是微藻培養更加現實的選擇。Sarat Chandra等[31]在3.4 L氣升式光生物反應器中培養淡水綠藻(Scenedesmusobtusus)，生物質生產率最大達到0.07 g/(L·d)，在較高光照強度下或連續光補充培養的S.obtusus能產生理想的生物柴油來源。

3.1.3 混合型光生物反應器

結合不同反應器的優勢，可設計出混合型光生物反應器耦合系統，使其滿足規模化培養微藻的需求。應降果[32]設計的列管柱式光生物反應器與跑道池耦合系統，受光性能良好并能快速釋放封閉式反應器中積累的熱量至跑道池，同時加強了跑道池中的CO2吸收效率。利用該耦合系統培養微藻，可使微藻生物量、面積得率及體積產率比對照跑道池提高49%。Lee等[33]構建了α型管狀混合型光生物反應器，可使光合有效輻射度和培養溫度更加均勻，其微藻生物量密度超過10 g/L，日產量達72 g/(m2·d)。Huang等[34]在反應器內部使用特殊混合器促進沿著光照梯度的混合，促進藻液的混合。使藻液與營養因子等外界因素均勻接觸。Ogbonna等[35]設計了一種新型內照明攪拌式光生物反應器，研究蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的規模培養，在反應器進行培養12 d后小球藻能獲得藻質量濃度1.37 g/L，生長速率為0.164 kg/(m3·d)。Sung等[36]設計了一種新型的培養系統，把4個平板光生物反應器串聯連接，通過一定的稀釋速率向第一反應器中加入新鮮培養基，使該系統經受連續的恒化器培養，以提高海洋富油微擬球藻(Nannochloropsisgaditana)的脂質生產力，其生物質產率可達20.0%以上，脂肪酸甲酯生產率達46.1%以上。

3.2 異養方式

微藻異養培養是指利用有機碳源維持藻類油脂積累及正常生長。微藻的異養分為3類：化能異養生長、光異養生長和光激活異養生長方式[37-38](見表2)。

表2 不同異養方式的特點[37-38]

3.2.1 化能異養

利用化能異養方式來實現規模化培養微藻主要有3種方式：分批、補料和連續培養。其中分批培養方式易于實施，但是隨著培養液中能量的消耗，藻類的生長受到抑制或者停止，因而難以達到高的密度。因此，目前較為常見的培養模式為補料培養和連續培養。

Morales-Sánchez等[39]使用葡萄糖作為補充碳源，對富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)進行異養培養，培養期間保持C/N比為17∶1，脂質含量(占藻體干重)最高可達52%，脂質生產力達528.5 mg/(L·d)。謝明[40]利用異養—稀釋—光誘導串聯培養技術在500 L發酵罐中對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)進行中試擴大培養，周期內藻細胞平均生長速率可達2.5 g/(L·h)，平均葡萄糖得率可達0.48 g/g，比生長速率可維持在0.025～0.03 h-1之間，可達到實驗室培養水平。

3.2.2 光異養

光異養是指在光照條件下，向含碳源的培養液中加入DCMU培養微藻的方法。DCMU是光合作用抑制劑，可抑制非環式光合磷酸化，使其不再產生NADPH，從而導致微藻PS Ⅱ的活性受到抑制，影響微藻的正常代謝。牛海亞等[41]以DNP為解偶聯劑，分別添加5×10-7、5×10-5mmol/L DNP，對小球藻(Chlorellasp. 484)進行光異養培養和混合培養，兩種模式下FACHB 484生長狀況未產生顯著不同。Yang等[42]在2 L光生物反應器中光異養培養小球藻(ChlorellaminutissimaUTEX2341)，雖然研究中的脂質產量相對較低，生物量為13.1%，但生物質總產量(干重)較高，總脂質含量可達0.95 g/L。

3.2.3 光激活異養

在沒有光合作用能量的情況下，專性光合自養生物不能生長和分裂，這是微藻代謝物的有效異養生成的主要障礙[43]。Anderson等[44]在對集胞藻(SynechocystisPCC 6803)進行5～10 min、40 μmol/(m2·s·d) 的光照培養，在完全黑暗中保持光激活異養生長，雖未對富油情況闡明，但此方式賦予富油微藻規模化培育新的可能。

3.3 混合培養

為結合自養培養和異養培養雙方的優勢，可采取混合培養，以光能和CO2等無機碳源為主，同時以有機碳源作為補充碳源。該培養方式中和了自養和異養兩種方式的優缺點，是一種比較高效的培養方式。Roostaei等[45]對小球藻(Chlorellavulgaris)和二形柵藻(Scenedesmusdimorphus)進行混合培養，最大限度地利用資源，消除光限制。與自養條件相比，混合培養的微藻生物量高出2～3倍，脂質積累高出2～10倍，從而實現了更大的生物量和脂質含量。

4 結束語

目前，微藻生物質能源仍處于探索階段，其中產油藻種的選育及其規模化培養是微藻生物能源的關鍵技術環節。這需要系統地研究不同誘變方式、培養方式以及光生物反應器等對微藻培育的影響。在產油藻種的選育及其規模化培養中，以下幾個方面有待進一步研究：建立富油藻種的選育規程，通過物理、化學誘變及基因工程等手段，配合不同微藻篩選方法，提高篩選的效率和速度，以獲得理想優勢的藻種；研究微藻的規模化培養系統，通過對自養、異養及混養方式特點的了解，以及根據微藻本身性能的差異，采用高密度微藻的光生物反應器，從而開發出高效、低成本、易實施的微藻培養方式。

盡管來自藻類的生物能源生產仍然過于昂貴，且無法與化石能源競爭，但其仍是一種具有前瞻性和可持續性的生物質能源來源。若能把微藻規模化培育與環境保護、污水防治相結合，將會進一步降低其培養成本，必將有利于微藻生物能源的長遠發展。